SDS碱裂解法制备质粒DNA（中量制备）
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原理
用碱和 SDS 处理可以从中度规模（20~50 ml）的细菌培养物中分离质粒 DNA，所获得的 DNA 产物可用于电泳分析或限制性内切核酸酶消化，经柱层析进一步纯化之后，还可用于转染哺乳动物细胞。
材料与仪器
碱裂解液 抗生素 乙酵 酚 氯仿 STE TE
LB、YT 或 Terrific 培养液
LB、YT 或 Terrific 培养液
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
(1) 碱裂解液Ⅰ
50 mmol/L 葡萄糖；25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
溶液Ⅰ一次可配制 100 ml，在 15 psi（1.05 kg/cm2）压力下蒸汽灭菌 15 min，保存于 4℃。
若欲用柱层析进一步纯化所制备的质粒 DNA，无菌的碱裂解液Ⅰ在使用前可补充以适当体积的去 DNA 酶的 RNA 酶 A（胰 RNA 酶）（20 mg/ml），使之终浓度为 100 μg/ml，若欲用其他的方法纯化 DNA，则不推荐在此步骤添加 RNA 酶。
(2) 碱裂解液Ⅱ
0.2 N NaOH（从 10 N 贮存液中现用现稀释）；1%（m/V）SDS。
溶液Ⅱ要现用现配，室温下使用。
(3) 碱裂解液Ⅲ
5 mol/L 乙酸钾 60.0 ml；冰乙酸 11.5 ml；H2O 28.5 ml。
所配成的溶液中钾的浓度为 3 mol/L，乙酸根的浓度为 5 mol/L。保存于 4℃，用时置于冰浴中。
(4) 用于筛选质粒的抗菌素
(5) 乙醇
(6) 异丙烷
(7) 酚：氯仿（1:1，V/V )
(8) STE
(9) TE（pH 8.0）含 20 μg/ml RNase A
2. 培养基
LB、YT 或 Terrific 培养液
3. 离心机和转头
Sorvall SS-34 转头或与之相当的转头。
二、方法
1. 细胞的制备
(1) 挑取转化后的单菌落，接种到 10 ml 含有适当抗生素的丰富培养基（LB、YT 或 Terrific 培养液）中，于 37℃ 剧烈振摇下培养过夜。
为确保培养物通气良好：试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大 4 倍；试管盖不宜盖得太紧；宜在剧烈振摇下温育。
(2) 将培养物转移到一个 15 ml 的试管中，于 4℃ 以 2000 g（用Sorvall SS-34 转头，4000 r/min）离心 10 min 后收集细菌。
(3) 用轻缓抽吸的方法，尽可能吸干培养液。
除去上清的简便方法是用一次性使用吸头或巴斯德吸管与一个真空管道和一个侧臂烧瓶相连。轻微抽吸，并使吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，以尽量避免沉淀被吸到侧臂烧瓶中去。也可用吸管（或巴斯德吸管）和吸球除去培养液，并用吸头除去管壁上附着的液滴。
未从细菌沉淀中除去所有培养液的后果是质粒不能被限制酶切期或不能完全切割。这是因为培养液中的细胞壁成分抑制多种限制酶的活性。这个问题可这样解决：用冰预冷的 STE（菌液体积的 0.25 倍）重悬细菌沉淀并离心。
2. 细胞的裂解
(1) 将细菌沉淀重悬于 200 μl 用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，将悬浮液转移到微量离心管中。
为确保细菌沉淀在碱裂解液Ⅰ中完全分散，将两个微量离心管的管底互相接触同时振荡，以提高细菌沉淀分散的速度和效率。
原方案（Birnboitn and Doly 1979 ) 要求在这一步用溶菌酶消化细菌细胞壁，如果待处理细菌培养物的体积少于 10 ml 时，这一步骤可以省略。
(2) 加 400 μl 新配制的溶液Ⅱ到每管细菌悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管 5 次，以混合内容物。切勿涡旋振荡！将离心管置于冰上。
应确保离心管的整个内壁均与碱裂液Ⅱ接触。
(3) 加 300 μl 冰预冷的碱裂解液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒数次，使之在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，然后将离心管置于冰上 3~5 min。
(4) 用微量离心机于 4℃ 以最大转速离心 5 min，转移 600 μl 上清到一只洁净离心管中。
(5) 加等体积的酚：氯仿，通过剧烈振荡混合有机相和水相，然后用微量离心机于 4℃ 以最大转速离心 2 min，转移上层水相到另一离心管中。
3. 质粒 DNA 的回收
(1) 在室温下加 600 μl 异丙醇以从上清中沉淀核酸，剧烈振荡混合溶液，于室温下放置 2 min。
(2) 用微量离心机在室温下以最大转速离心 5 min，收集核酸沉淀。
(3) 按上述步骤 3 所述小心吸去上清液，将离心管倒置于纸巾上，使所有液体流干，再将吸附于管壁上的液滴除尽。
(4) 加 1 ml 70% 乙醇于沉淀中并将盖紧的试管顛倒数次，用微量离心机在室温下以最大转速离心 2 min，回收 DNA。
(5) 再次用轻微抽吸的方法（步骤 3 ) 除去上清。
这一步骤要格外小心，因为沉淀有时贴壁不牢。
(6) 除去管壁上的酒精液滴，将开口的试管置于室温直到酒精挥发并在管内没有可见的液体存在（2~5 min)。
如果用干燥器或真空干燥的方法干燥 DNA 沉淀，在某些情况下它会变得难以溶解并且可能变性（Svaren et al. 1987)。将沉淀在室温下干燥 10~15 min 对于乙醇挥发来说足够了，而且不会引起 DNA 脱水。
(7) 用 100 μl 含有去 DNA 酶的 RNase A（胰 RNA 酶）（20 μg/ml）的 TE 重新溶解核酸，温和振荡几秒钟，贮存于 -20℃。
1. 缓冲液和溶液
(1) 碱裂解液Ⅰ
50 mmol/L 葡萄糖；25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
溶液Ⅰ一次可配制 100 ml，在 15 psi（1.05 kg/cm2）压力下蒸汽灭菌 15 min，保存于 4℃。
若欲用柱层析进一步纯化所制备的质粒 DNA，无菌的碱裂解液Ⅰ在使用前可补充以适当体积的去 DNA 酶的 RNA 酶 A（胰 RNA 酶）（20 mg/ml），使之终浓度为 100 μg/ml，若欲用其他的方法纯化 DNA，则不推荐在此步骤添加 RNA 酶。
(2) 碱裂解液Ⅱ
0.2 N NaOH（从 10 N 贮存液中现用现稀释）；1%（m/V）SDS。
溶液Ⅱ要现用现配，室温下使用。
(3) 碱裂解液Ⅲ
5 mol/L 乙酸钾 60.0 ml；冰乙酸 11.5 ml；H2O 28.5 ml。
所配成的溶液中钾的浓度为 3 mol/L，乙酸根的浓度为 5 mol/L。保存于 4℃，用时置于冰浴中。
(4) 用于筛选质粒的抗菌素
(5) 乙醇
(6) 异丙烷
(7) 酚：氯仿（1:1，V/V )
(8) STE
(9) TE（pH 8.0）含 20 μg/ml RNase A
2. 培养基
LB、YT 或 Terrific 培养液
3. 离心机和转头
Sorvall SS-34 转头或与之相当的转头。
二、方法
1. 细胞的制备
(1) 挑取转化后的单菌落，接种到 10 ml 含有适当抗生素的丰富培养基（LB、YT 或 Terrific 培养液）中，于 37℃ 剧烈振摇下培养过夜。
为确保培养物通气良好：试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大 4 倍；试管盖不宜盖得太紧；宜在剧烈振摇下温育。
(2) 将培养物转移到一个 15 ml 的试管中，于 4℃ 以 2000 g（用Sorvall SS-34 转头，4000 r/min）离心 10 min 后收集细菌。
(3) 用轻缓抽吸的方法，尽可能吸干培养液。
除去上清的简便方法是用一次性使用吸头或巴斯德吸管与一个真空管道和一个侧臂烧瓶相连。轻微抽吸，并使吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，以尽量避免沉淀被吸到侧臂烧瓶中去。也可用吸管（或巴斯德吸管）和吸球除去培养液，并用吸头除去管壁上附着的液滴。
未从细菌沉淀中除去所有培养液的后果是质粒不能被限制酶切期或不能完全切割。这是因为培养液中的细胞壁成分抑制多种限制酶的活性。这个问题可这样解决：用冰预冷的 STE（菌液体积的 0.25 倍）重悬细菌沉淀并离心。
2. 细胞的裂解
(1) 将细菌沉淀重悬于 200 μl 用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，将悬浮液转移到微量离心管中。
为确保细菌沉淀在碱裂解液Ⅰ中完全分散，将两个微量离心管的管底互相接触同时振荡，以提高细菌沉淀分散的速度和效率。
原方案（Birnboitn and Doly 1979 ) 要求在这一步用溶菌酶消化细菌细胞壁，如果待处理细菌培养物的体积少于 10 ml 时，这一步骤可以省略。
(2) 加 400 μl 新配制的溶液Ⅱ到每管细菌悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管 5 次，以混合内容物。切勿涡旋振荡！将离心管置于冰上。
应确保离心管的整个内壁均与碱裂液Ⅱ接触。
(3) 加 300 μl 冰预冷的碱裂解液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒数次，使之在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，然后将离心管置于冰上 3~5 min。
(4) 用微量离心机于 4℃ 以最大转速离心 5 min，转移 600 μl 上清到一只洁净离心管中。
(5) 加等体积的酚：氯仿，通过剧烈振荡混合有机相和水相，然后用微量离心机于 4℃ 以最大转速离心 2 min，转移上层水相到另一离心管中。
3. 质粒 DNA 的回收
(1) 在室温下加 600 μl 异丙醇以从上清中沉淀核酸，剧烈振荡混合溶液，于室温下放置 2 min。
(2) 用微量离心机在室温下以最大转速离心 5 min，收集核酸沉淀。
(3) 按上述步骤 3 所述小心吸去上清液，将离心管倒置于纸巾上，使所有液体流干，再将吸附于管壁上的液滴除尽。
(4) 加 1 ml 70% 乙醇于沉淀中并将盖紧的试管顛倒数次，用微量离心机在室温下以最大转速离心 2 min，回收 DNA。
(5) 再次用轻微抽吸的方法（步骤 3 ) 除去上清。
这一步骤要格外小心，因为沉淀有时贴壁不牢。
(6) 除去管壁上的酒精液滴，将开口的试管置于室温直到酒精挥发并在管内没有可见的液体存在（2~5 min)。
如果用干燥器或真空干燥的方法干燥 DNA 沉淀，在某些情况下它会变得难以溶解并且可能变性（Svaren et al. 1987)。将沉淀在室温下干燥 10~15 min 对于乙醇挥发来说足够了，而且不会引起 DNA 脱水。
(7) 用 100 μl 含有去 DNA 酶的 RNase A（胰 RNA 酶）（20 μg/ml）的 TE 重新溶解核酸，温和振荡几秒钟，贮存于 -20℃。
来源：丁香实验
