质粒DNA的微量制备

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实验原理

质粒（Plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传的因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主的进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。目前，质粒已广泛的用作基因工程中目的基因地运载工具—载体 。从大肠杆菌中提取质粒DNA，是一种分子生物学最基本的方法。

质粒DNA分离纯化方法有多种，但其原理和步骤都大同小异。本实验着重介绍碱裂解法 制备微量DNA。

在EDTA存在的条件下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜 崩解，从而达到菌体充分的裂解。此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量染色体DNA，实验中加入蛋白质水解酶和核糖核酸酶，可以使它们分解，通过碱性酚（pH8.0）和氯仿－异戊醇混合液的抽提可以除去蛋白质。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少抽提过程中产生的泡沫，并能使离心后水层、变性蛋白层和有机层维持稳定。含有质粒DNA的上清液用乙醇或异丙醇沉淀，获得质粒DNA。

在实验过程中，由于细菌 裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用，染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在，因此，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA外，还可能有少部分染色体DNA和RNA，必要时可进一步纯化。

试剂和器材

一、试剂

1. LB 液体培养基

胰蛋白胨10g/L, 酵母浸膏5g/L，NaCl 10g/L, 用NaOH调节至pH7.5，高压灭菌。

2. TEG缓冲液（pH8.0 25mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L EDTA , 50mmol/L葡萄糖，4mg/mL 溶菌酶）

称取0.3g Tris加入0.1mol/L HCl溶液14.6mL，先配制成pH8.0 Tris-HCl缓冲液100mL，再加入0.37g EDTA·Na2·2H2O和0.99g葡萄糖，临用前加入400mg溶菌酶。

3. 碱裂解液（0.2mmol/L NaOH, 1% SDS）

称取0.8g NaOH和1g SDS定容至100mL

4. 乙酸钾溶液(pH8.0, [K+]=3mol/L, [Ac-]=5mol/L)

取60mL mol/L KAc加入11.5mL冰乙酸和28.5mL蒸馏水

5. 1mol/L pH8.0 Tris－HCl缓冲液

Tris 121.14g/L, 用盐酸调至pH8.0