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酵母DNA微量制备

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实验步骤

 

1. 酵母DNA微量制备(40ml)

   1) 在125ml三角瓶中用40ml YPD培养液在30℃条件下培养细胞达最大生长量(过夜)。

   2) 将上述培养物移入螺盖离心管,用医用离心机或Sorvall SS-34转头以5000r/min离心5分钟,弃去上清液。

   3) 将细胞悬浮在3ml的0.9mol/L山梨醇-0.1mol/L Na2 EDTA(pH7.5)溶液中。

   4) 加0.1ml的2.5mg/ml消解酶100T,置37℃条件保温1小时。

   5) 用医用离心机或Sorvall SS-34转头以5000r/min离心5分钟,弃去上清液。

   6) 将细胞重新悬浮在5ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L醋酸钠溶液中。

   7) 加0.5ml的10%十二烷基硫酸钠(SDS),混匀。

   8) 置65℃保温30分钟。

   9) 加1.5ml的5mol/L醋酸钾溶液,在冰浴上放置1小时。

   10) 用Sorvall SS-34转头以1000r/min离心10分钟。

   11) 将上清液转移至干净的塑料离心管中,室温下加入两倍体积的95%乙醇,混匀,以5000~6000r/min离心15分钟。

   12) 弃上清液,将沉淀物干燥,然后悬浮在3ml TE缓冲液(pH7.4)中,此操作可能需要几个小时。

   13) 用Sorvall SS-34转头以1000r/min离心15分钟,将上清液转移到一个新试管,弃沉淀物。

   14) 加入150μl的1mg/ml RNaseA溶液,在37℃下保温30分钟。

   15) 加入一倍体积的100%异丙醇,轻轻混匀,取出呈松散纤维状的沉淀物,无需离心,让其自然干燥。

   16) 将沉淀物悬浮在0.5ml TE缓冲液(pH7.4)中,置4℃保存。酵母DNA的最终浓度约为200μg/ml。如果最后的溶液混浊不清,用异丙醇再次沉淀DNA或用Sorvall SS-34转头以1000r/min离心15分钟。

2. 酵母DNA微量制备(5ml)

   1) 按酵母于5ml YPD中,置30℃培养过夜。

   2) 用医用离心机以2000r/min离心5分钟沉淀细胞,弃上清液。

   3) 将细胞悬浮在0.5ml的1mol/L山梨醇-0.1mol/L Na2 EDTA(pH7.5)缓冲液中,转动一支1.5ml离心管中。

   4) 加入0.02ml的2.5mg/ml的消解酶100T溶液,置37℃保温1小时。

   5) 离心1小时。

   6) 弃上清液,把细胞悬浮在0.5ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L Na2 EDTA溶液。

   7) 加0.05ml的10% SDS,混匀。

   8) 置65℃保温混合物30分钟。

   9) 加0.2ml的5mol/L醋酸钾,把离心管在冰浴中放置1小时。

   10) 离心5分钟。

   11) 将上清液转移到一洁净微型离心管,室温下加入等体积的无水异丙醇,混匀,放置5分钟。短暂离心(10秒钟)弃上清液,让沉淀自然干燥。

   12) 用0.3ml TE缓冲液(pH7.4)重新悬浮沉淀。

   13) 加入15μl的1mg/ml的RNaseA溶液,置37℃保温30分钟。

   14) 加0.03ml的3mol/L醋酸钠,混匀,用0.2ml的无水异丙醇沉淀,再短暂离心收集DNA。

   15) 弃上清液,自然干燥,用0.1~0.3ml TE缓冲液(pH7.4)重新悬浮DNA。

   16) 在使用限制性内切酶酶解DNA之前,有必要将最终浓度溶液离心较长时间(15分钟)以便除去可能抑制酶解的不溶性物质。

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