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酿酒酵母的生长及其DNA的制备

相关实验:酿酒酵母的生长及其 DNA 的制备

最新修订时间:

原理

用这一方法制备的 DNA 适用于琼脂糖凝胶电泳、Southern 印迹、亚克隆、基因组文库构建、PCR 或其他不需要完整的高分子质量 DNA 的方法。

材料与仪器

YAC 克隆的酵母菌落
醋酸铵 乙醇 酚 氯仿 TE Triton SDS 溶液
YPD 培养基 Sorvall SS-34 转头或同类产品 玻璃珠

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

醋酸铵(10 mol/L )

乙醇

酚:氯仿(1:1,V/V)

TE ( pH 8.0)

含 20 μg/ml RNase 的 TE ( pH 8.0)

Triton/SDS 溶液

2. 培养基

YPD 培养基

3. 离心机和转头

Sorvall SS-34 转头或同类产品

4. 专用设备

玻璃珠

5. 载体和酵母菌株

携带目的 YAC 克隆的酵母菌落

二、方法

细胞培养

1. 将一个含目的 YAC 克隆的酵母菌落接种到 10 ml YPD 培养基中,30℃ 振摇过夜。

2. 2000 g ( Sorvall SS-34 转头,4100 r/min) 离心 5 min 收集细胞。

3. 弃去培养基,加 1 ml 无菌水,轻轻振动,使细胞悬浮于溶液中。

4. 按步骤 2 的方法收集细胞。

5. 去除上清,将细胞重悬于 0.5 ml 无菌水,然后移入一 1.5 ml 无菌离心管中。

6. 室温下在微量离心机中以最大转速离心 5 s,去除上清,收集细胞。

DNA 的提取

7. 加入 0.2 ml Triton/SDS 溶液于细胞中,轻叩离心管侧壁,使细胞沉淀重新悬浮。

8. 加入 0.2 ml 酚: 氯仿和 0.3 g 玻璃珠。室温振荡 2 min。加 0.2 ml TE ( pH 8.0),稍加振荡,使体系混匀。

9. 室温下,在微量离心机中以最大转速离心 5 min,使有机相和水相分开。将上层水相移入另一新的离心管中。小心操作,避免将两相界面处的物质吸入。

DNA 的分离

10. 加入 1 ml 乙醇到水相中,盖上管盖,将小管轻轻翻转数次,混匀。

11. 在微量离心机中以最大转速 4℃ 离心 2~5 min, 使 DNA 形成沉淀。用巴斯德吸管吸去上清。再次进行短暂的离心(2 s ), 除去离心管底部最后残余的乙醇。

12. 用 0.4 ml 含 RNase 的 TE ( pH 8.0 ) 溶解核酸沉淀,然后在 37℃ 温育 5 min。

13. 加入等体积酚: 氯仿溶液抽提经 RNA 酶消化后的溶液。最好用翻转离心管的方法混匀,不要用涡旋振荡。室温下,在微量离心机中以最大转速离心 5 min, 使水相和有机相分层。将水相移入另一新离心管中。

14. 在水相中加入 80 μl 10 mol/L 醋酸铵和 1 ml 乙醇。轻轻地翻转小管进行混匀。室温放置 5 min。

15. 微量离心机离心 5 min 收集 DNA 沉淀。弃上淸,用 0.5 ml 70% 乙醇灌洗核酸沉淀。 以最大转速离心 2 min, 用巴斯德吸管吸去乙醇漂洗液。再次进行短暂的离心(2 s), 吸去离心管底部最后残余的乙醇。将 DNA 沉淀在空气中干燥 5 min,然后用 50 μl TE (pH 8.0) 溶解。

来源:丁香实验

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