组织DNA的制备
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(1)将200mg组织在冰浴条件下用消毒剪刀充分剪碎,加4ml 1×RSB缓冲液(10mmol/L Tris, pH7.4;10mmol/l NaCl;25mmol/L EDTA,pH7.4)放入10ml带盖的塑料管中。
(2)加SDS至浓度为1%(可加0.4ml10%SDS),混匀。由于DNA从核中释放出来,样品变得粘稠。
(3)加10mg/ml蛋白酶k 44μl,终浓度为100μl/ml,37℃保温1~3d,直到组织完全解体。中间可振动样品管几次。加0.4ml 5mol/L NaCl。
(4)用等体积饱和酚、1/2体积饱和酚和1/2体积氯仿-异戊醇及等体积氯仿-异戊醇(24:1)各抽提一次,3000rpm离心5min,用大口钝缘吸管小心吸取上层水相。
(5)加2.5倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA。用一玻璃棒收集白色纤维丝状的大片段DNA,并移入一新管,吸干DNA中的无水乙醇。
(6)DNA溶于4ml 0.1×SSC中,4℃过夜可作进一步纯化。
(7)加20μl RNase A(10mg/ml),37 ℃保温5h。加0.4ml 5mol/L NaCl。
(8)同上法用饱和酚、氯仿-异戊醇抽提,乙醇沉淀离心,弃上清。
(9)75%乙醇洗涤2次,离心,弃上清,真空抽干。适量1×TE溶解,保存在4℃。
(2)加SDS至浓度为1%(可加0.4ml10%SDS),混匀。由于DNA从核中释放出来,样品变得粘稠。
(3)加10mg/ml蛋白酶k 44μl,终浓度为100μl/ml,37℃保温1~3d,直到组织完全解体。中间可振动样品管几次。加0.4ml 5mol/L NaCl。
(4)用等体积饱和酚、1/2体积饱和酚和1/2体积氯仿-异戊醇及等体积氯仿-异戊醇(24:1)各抽提一次,3000rpm离心5min,用大口钝缘吸管小心吸取上层水相。
(5)加2.5倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA。用一玻璃棒收集白色纤维丝状的大片段DNA,并移入一新管,吸干DNA中的无水乙醇。
(6)DNA溶于4ml 0.1×SSC中,4℃过夜可作进一步纯化。
(7)加20μl RNase A(10mg/ml),37 ℃保温5h。加0.4ml 5mol/L NaCl。
(8)同上法用饱和酚、氯仿-异戊醇抽提,乙醇沉淀离心,弃上清。
(9)75%乙醇洗涤2次,离心,弃上清,真空抽干。适量1×TE溶解,保存在4℃。