DNA亲和介质的制备

1) 在1个1.5 mL的微量离心管中准备下面物质的混合物：含有每种寡核苷酸440μg的TE缓冲液，总体积为130μL。再加入20μL 10×T4噬菌体多核苷酸激酶缓冲液。88℃温育2 min, 65℃10 min, 37℃10 min,室温 5 min。

2) 将上述混合物平均分入2个微量离心管中。每管（75μL)加15μL 20 mmol/L ATP (pH 7.0)、约 5μ Ci [γ-32P] ATP, 10μL 10 U/μL T4 噬菌体多核苷酸激酶（共 100 U)。37℃温育 2 h。

加标记的ATP时，不要化冻，仅需用移液器的黄色吸头触碰一下（不要刺入）冻结的[32P] ATP的上层，取少许转入反应管中。

3) 每管中加50μL 10 mol/L乙酸铵及100μL水，65℃加热15 min,灭活激酶，冷却至室温。

4) 加入750μL 100%乙醇，上下颠倒混合。室温下高速离心15 min沉淀DNA，弃去上清。

5) 各DNA沉淀重悬于225μLTE缓冲液中。

6) 加250μL酚/氯仿/异丙醇于各管中。在涡旋混合器上振荡1min。高速离心5 min分离两液相，将水相（上层）移至一新管中。

7) 加250μL氯仿/异戊醇至水相中。在涡旋混合器上振荡1 min,高速离心5 min 分离两液相，将水相（上层）移至一个新管中。

8) 加25μL 3 mol/L乙酸钠至水相中，振荡混匀。然后加入750μL 100%乙醇，上下颠倒混匀，高速离心15 min沉淀DNA，弃去上清。

9) 用800μL75%乙醇洗涤沉淀，在涡旋混合器上振荡混匀，高速离心5 min,弃去上清。

10) 在真空旋转蒸发器（如Speedvac)中干燥DNA沉淀。

11) 加65μL水及10μL 10×接头/激酶缓冲液至每管沉淀中，在涡旋混合器上振荡使 DNA 溶解。加20μL 20 mmol/L ATP (pH 7.0)及 5μL 6000 U/mL T4 噬菌体DNA连接酶（30 Weiss单位）。在室温下温育>2 h,或者15℃过夜。

取决于所用的寡核苷酸，连接的最佳温度可在4〜30℃之间变化。

12) 用琼脂糖凝胶电泳监测连接反应，每道加0.5μL连接反应液，并同时带分子质量标记物。用溴化乙锭染色并在紫外灯下观察DNA。

如果未发生连接反应，用25: 24 : 1酚/氯仿/异戊醇抽提DNA 1次，用24 : 1氯仿/异戊醇抽提 1次，然后用乙酸钠加乙醇沉淀DNA。重新将DNA溶于225μL TE溶液中，加25μL 3mol/L的 乙酸钠溶液，再加750μL无水乙醇重新沉淀。用75%乙醇洗涤，在Speedvac中干燥，然后重新进行连接反应。

13) 加100μL缓冲液平衡酚至1OOμL连接反应液中。在涡旋混合器上振荡1 min,室温下高速离心5 min,将水相（上层）移至一新管中。

14) 加100μL氯仿/异戊醇至水相中。在涡旋混合器上振荡1 min，室温高速离心5 min,将水相（上层）移至一新管中。

15) 加33μL10 mol/L乙酸铵至水相中，在涡旋混合器上振荡混勻。

16) 加133μL异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃放置20 min。高速离心15 min沉淀 DNA，弃去上清。

乙酸铵/异丙醇沉淀可除去残余的ATP，不然后者将影响连接的DNA与溴化氰活化琼脂糖的偶联。

17) 225μLTE缓冲液，在涡旋混合器上振荡使沉淀溶解，加25μL 3 mol/L乙酸钠，在涡旋混合器上振荡混匀。加750μL 100%乙醇，上下颠倒混匀，高速离心15 min 沉淀DNA，弃去上清。

18) 用75%乙醇洗涤DNA 2次，在真空蒸发器（如Speedvac)中抽干DNA沉淀。

19) 将DNA溶解于50μL水中，-20℃保存。

不要将DNA溶于TE缓冲液中，因为TE中的Tris缓冲盐将影响偶联反应。

注意：在进行以下步骤之前，最好是准备好激活和偶联反应所需的所有仪器和试剂，不要让介质变干。

20) 将10〜15 mL (稳定后的柱床体积）Sepharose CL-2B置于一个60 mL粗烧结玻璃漏斗中，用500 mL水充分洗涤。

21) 将湿的Sepharose介质移至一个25 mL量筒中，大约有10 mL介质，加水至终体积 20 mL。将所得的混悬液移至一个150 mL的玻璃烧杯中，内有磁力搅棒。将烧杯置于水浴中平衡至15℃,在通风橱内放在磁力搅拌器上，以中慢速搅拌。

22) 在通风橱内，称量1.1 g溴化氰装入一个25 mL的三角锥瓶中，用Parafilm膜或磨 砂玻璃盖尽可能地盖住瓶口（稍多于1.1 g比稍少为好）。加2 mL N，N-二甲基甲酰胺（溴化氰将立即溶解）。在1 min内，将溴化氰溶液逐滴加入搅拌中的琼脂糖浆液中。

注意：溴化氰是剧毒及挥发性物质，只能在通风橱内特别小心地使用。小心清除所有的溴化氰废液很重要！在通风橱内，加固体氢氧化钠和甘氨酸（约10〜20 mg/mL)以灭活溴化氰，以相似的溶液浸泡污染的器具，让其在通风橱中放过夜再弃去。

23) 立即按以下方法加5μL mol/L NaOH：每10 s加30μL 至搅拌的混合物中，加10 min 直至1.8 mL NaOH加完。

为了方便起见，在反应之前，可以先量好1.8 mL NaOH溶液放到一个小管子里，这就避免了换吸头时额外增加的10 s。

24) 马上加100 mL冰冷的水至烧杯中，并将混合物倒入一个60 mL粗烧结玻璃漏斗中。

25) 仍在通风橱中进行操作，用100 mL冰冷的水（<4℃)在漏斗中洗介质4次。接着 用100 mL冰冷的10 mmol/L磷酸钾（pH 8.0)洗2次。

26) 立即将介质移入1个15 mL聚丙烯螺口盖的管子中，加约4 mL 10 mmol/L磷酸钾 (pH 8.0)直至介质成为均匀的稠浆。

27) 立即加入步骤19中的2份50μL DNA溶液。室温下置于转轮上温育过夜(>8 h)

28) 在通风橱内，将介质移入一个60mL粗烧结玻璃漏斗中，用100 mL水各洗2次， 再用100 mL 1 mol/L pH 8.0的盐酸乙醇胺洗1次。

用盖革氏计数器，比较滤出液及洗过的介质的放射活性水平，从而估计DNA结合到介质上的效率。通常，所有检测到的放射活性都在介质中。

29) 在通风橱内，将介质移入一个15 mL的带螺口盖的聚丙烯管中，加1 mol/L盐酸乙醇胺（pH 8.0)至混合物成为平滑的浆状。室温下将该管置于转轮上温育2〜4 h。

30) 在60 mL粗烧结玻璃漏斗中，依次用100 mL 10 mmol/L碟酸钾（pH 8.0)、100 mL

1 mol/L磷酸钾（pH 8.0)、100 mL 1 mol/L氯化钾、100 mL水及100 mL柱储存缓冲液洗介质。

31) 将介质保存于4℃ (至少可稳定1年，不要冻结）。

其他所需：

10 mol/L乙酸铵，25:24 : 1 (V/V/V)酚/氯仿/异戊醇，24 : 1 (V/V)氯仿/异戊醇，3 mol/L乙酸钠 100% 及75% (V/V)乙醇，10×接头/激酶缓冲液，6000 U/mL T4 噬菌体 DNA 连接酶（以 Weiss 单位测定；New England Biolabs)，缓冲液平衡酚，异丙醇，Sepharose CL-2B (Pharmacia Biotech)，溴化氰（CNBr Aldrich)，N N-二甲基甲酰胺 5 mol/L NaOH，lO mmol/L及1 mol/L磷酸钾缓冲液 pH 8.0，l mol/L盐酸乙醇胺 pH 8.0固体氢氧化钠，甘氨酸，1 mol/L KCl，柱储存缓冲液