【急】动物组织提取DNA

动物组织提取DNA

用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性, 可以直接从生物材料中提取DNA。

由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合, 而阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。

1.实验前动物应饥饿12h以上。

2.称取组织，放在培养皿中，用剪刀剪碎，放入匀浆器研磨,加入6ml，氯化钠-柠檬酸钠缓冲液，装在10ml 离心管中。将匀浆物在4000r/min下离心1 0min。

3.将上述沉淀转入50m1大试管中，加入6ml氯化钠-柠檬酸钠缓冲溶液、3ml 氯仿-异戊醇混合液，0. 5m1SDS使其终浓度为0.41%,手摇15min，然后缓慢加入氯化钠固体(有0. 55g)，使其终浓度为1mol/L。慢摇5min是氯化钠充分溶解。

4.将上述混合液在4000r/min离心15min， 取上清液于50ml烧杯中加入等体积冷95%乙醇，边加边用玻璃棒慢慢搅动，将缠绕在玻璃棒的凝胶状物用滤纸吸取多余的Z醇，即得DNA粗品。

5.显色反应:取上述反应物2ml加入二苯胺试剂2ml沸水浴加热，观察颜色。

以下是酚氯仿法提取组织DNA的流程及所需试剂：

材料：

组织样本

离心管

液氮

酚/氯仿/异戊酮 (25:24:1)

氯仿

乙醇（70%和绝对乙醇）

TE缓冲液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）

RNase A（10 mg/mL）

步骤：

将组织样本切成小块，用液氮冷冻保存。

将组织块放入离心管中，加入约10倍体积的酚/氯仿/异戊酮，用匀浆器彻底打碎。

在室温下振荡混合离心管，离心10分钟（12000g，4°C）。

将上层的上清液转移到新的离心管中，加入等体积的氯仿，振荡混合离心管，离心10分钟。

将上层上清液转移到新的离心管中，加入等体积的乙醇（70%），混合均匀。

将混合液转移到DNA捕获柱中（或者用纱布滤去组织碎片），离心柱上样。

用洗涤缓冲液（含乙醇）洗涤柱，去除杂质。

加入低盐洗涤缓冲液（含乙醇），洗涤柱，去除残留的盐和其他杂质。

加入去离子水洗涤柱，将DNA洗脱，转移至新的离心管中。

加入RNase A（终浓度为100 μg/mL），37℃孵育30分钟，去除RNA污染。

用紫外分光光度计测定DNA的浓度和A260/A280比值。

注意事项：

在提取过程中要注意防止DNA受到污染，如手套、纯水、无菌环境等。

离心步骤要保证离心管密闭，离心过程中不能晃动或震动。

贮存DNA时要避免受到紫外线照射和高温，以保证DNA的完整性和稳定性。

动物组织DNA提取步骤

1、处理材料：取动物组织10mg，尽量切碎，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。

2、加入20μl蛋白酶K溶液，混匀后56℃水浴，直至组织溶解。简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。

3、加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁水珠。

4、加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。（沉淀DNA）

5、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12,000rpm（～13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。（吸附沉淀）

6、向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（～13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

7、 向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW（使用前先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（～13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

8、向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm（～13,400×g）离心30s，倒掉废液。（6、7、8为漂洗）

9、将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm（～13,400×g）离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的PCR等实验。

10、将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm（～13,400×g）离心2min，将溶液收集到离心管中。（溶解洗脱DNA）

注意：采用硅基质膜吸附的DNA，可将DNA在低盐高pH值条件下洗脱下来。pH值在7.0-8.5之间洗脱效率较高，pH值低于7.0则洗脱效率很低。

洗脱缓冲液体积不应该少于50μl，体积过小影响回收效率。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm（～13,400×g）离心2min。DNA产物应保存在-20℃，以防止DNA降解。