从猪脾中提取DNA

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1. 操作步骤:
取鲜猪脾,去脂、血,称取10g,用预冷的1×SSC溶液洗2次，剪碎。
按睥：1×SSC=1; 5W/V 加入50ml预冷的1×SSC，用高速组织
捣碎机破碎8次,每次5秒,中间间隔30秒。
将匀浆液放在烧杯中， 于冰盐浴中冷却30分钟。4000转/分钟离心10分钟。充掉上清。沉淀物中再加2倍体积的1×SSC搅匀，离心，弃上清，重复2次。
将所得沉淀悬于5倍体积的PH8.0、0.15MNaCL—0.1Na2MEDTA 溶液中。边搅拌边漫漫滴加5%SDS最终浓度达1%为止。然后加入固体氯化钠使其最终浓度达1mol/L，继续搅60分钟，以确保氯化钠全溶。所得混合液倒入磨口塞的锥形瓶中，加入同体积氯仿—异戊醇，激烈振荡20分钟，4000r离心20分钟，上层水相取出后倒入烧杯，以同积氯仿—异戊醇重复去蛋白2次。
取出水相于烧杯中，逐渐加入2倍体积95%乙醇，玻棒搅动，DNA纤维绕于璃玻棒上后挤干，用70%乙醇洗DNA纤维2次，用95%乙醇洗一次，再用乙醚洗一次，取出并挤干。

2. 实验材料，仪器和试剂：
（1） 实验材料：新鲜猪脾：
（2）仪器：量筒：1×10、3×100烧杯：2×100，2×250；磨口锥形瓶：1×250、1×500；吸管：1×1、1×10；滴管、玻棒、离心机 、电动搅拌器、台秤、剪刀、镊子。
（3） 试剂：
① 20×SSC：175.2gNaCL，88.2g柠檬酸钠•2H2O，PH=7.0加水至1000ml；
② 1×SSC，0.1×SSC由①做相应的稀释得来；
③ NaCL-Na2EDTA 液：8.77gNaCL，3.72gNa2EDTA溶于800ml蒸馏水中，用固体NaOH调PH=8后定容至1000；
④ 5%SDS（W/V）：6gSDS溶于100ml45%乙醇中；
⑤ 氯仿-异戊醇=24：1（体积比）
⑥ 其他:95%乙醇，盐冰.数据:DNA重,产率:

二苯胺显色法测定DNA含量
强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸 。其中2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω―羟基―γ―酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400μg范围内光密度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。

1.二苯胺试剂：使用前称取0.8g二苯胺（需在70%乙醇试剂中重结晶2次)，溶于180ml冰乙酸中，再加入8ml过氯酸（60%以上），混匀待用，临用前加入0.8ml 1.6%乙醛溶液，所配试剂应为无色。
　　 每组需56ml
共需2800ml
2.DNA标准溶液：（须经定磷法确定其浓度）取标准DNA以0.01N NaOH配成200微克／毫升的标准液。
每组需12ml
共需600ml
3.1.6%乙醛：取47%乙醛3.4ml，加重蒸水定容至100ml（放于冰箱中，一周之内可以使用）。
　　 共需70ml
4.(测样品液：准确称取猪脾DNA或用紫外分光法中剩下的DNA液配成10微克／毫升的溶液。
　　 每组需4ml
　　 共需200ml

操作方法：
1. DNA标准曲线的制定：
取10支试管，分成2组，依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mlDNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2ml。另取2只试管，各加2ml蒸馏水作为对照。然后各加入4ml二苯胺试剂，混匀。于60 恒温水浴中保温1h，冷却后于595nm处进行比色测定。取两管平均值，以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 制品的测定：
取2支试管，各加2ml待测液（内含DNA应在标准曲线的可范围之内）和4ml二苯胺试剂，摇匀。其于操作同标准曲线的制作。
3. 根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值DNA的含量，计算出制品中的百分含量。