HA-DNA 基质和薄膜的制备

HA-DNA 基质和薄膜的制备

材料

试剂

己 二 酸 二 酰 胼（ADH; Sigma-A ldrich )

A nti-F lag 抗 体（S g m a -A ldrich ) ，

C0 S——1 细 胞（A T C C ， R ockville, M aryland )

二 甲 基 甲 酰 胺（Sigma-A ldrich)

D M EM 培 养 基（C ellgro ， H ein d o n ， V irginia)

乙 基 -3- [3-二 甲 氨 基 ] 丙 基 碳 二 亚 胺（ED C I) (Sigma-A ldrich )

胎 牛 血 清（FB S ) (C ellgro)

FGM -2. B ulletK its 培 养 基（R oche D iagnostics)

H A 定 量 试 剂 盒（C orgenix ， W e stm in ste r, Colorado)

H oescht 33342 突 光 染 料（e x : 485n m ， e m : 530n m ; M olecular P ro b es).

H A ( K raeber G m bH & Co. ， W a ld h o fstr， G erm an y ) 储 存 液（10m g/m l，i. e. ,1% )

透 明 质 酸 酶（S g m a -A ldrich)

盐酸 ， lm o l/ L H C l

异 丙 醇（8 0 % 、 9 0 % 和 1 0 0 % ; F ischer C hem ical)

MC 285 兔抗鼠 H A S 2 多克隆抗体（来自 D r. John M cD onald, U niversity of U ta h )和 过 氧 化 物 酶 标 记 的 羊 抗 兔 二 抗

正 常 的 新 生 人 皮 肤 成 纤 维 细 胞（N N H D F ; C lonetics)

磷 酸 盐 缓 冲 液（P B S , Sigma-A ldrich )

质 粒 D N A (p D N A ，不同浓度），溶于无菌水

pFlag-C M V -5a 哺乳动物表达载体

这个载体有 c D N A 编码的 P D G F 或 H A S 2 克隆位点。

P D G F 检 测 试 剂 盒 Q uantikine E L IS A K it (R & D S ystem s)

仪器

铝质称重盘（灭菌，直径 4 mm) (V W R S cien tific )

细 胞 荣 光 计 C ytofluorom eter (C ytofluor-I I ， B iosearch， B edford， M assach u setts)

37°C 培 养 箱（V W R Scientific)

冻 干 机（Freezem obile 12E L ， G ard in er, N ew Y o rk )
振 荡 摇 床（L abQ uake shaker L-1237， Lab In d u strie s， B erkeley， C alifornia)

方法

HA-DNA 基质和薄膜的制备

1•将 I m l 合适的 p D N A 溶液和 20m l 的 I % 的 H A 溶液缓慢混合。

2.将 8m l 上 述 H A /p D N A 混合物转移到每个铝盘。然后按如下步骤操作。

H A-D N A 基质

a . 突然冷冻，并冻干 HA-DNA 混合物形成固体 HA-DNA 基质。

b •将 IOOmg A D H 溶解在 9 0 % D M F /10% H 2O 的 IOOml 混合溶液中。将上述固体H A -D N A 基质与此 A D H 溶液培养 30m i n 。

c•将 120 mg EDCI 溶解在上一步的混合物中，并 用 lm o l/L 的 H C l 调 节 p H 至 5 启动交联反应。

d•倒出溶液，倒 人 I O Oml 9 0 % 的异丙醇，并反复用 9 0 % 异丙醇洗涤 H A -D N A 基质，最后用 100% 异丙醇洗涤一次。

e. 将 H A -D N A 基质抽干。干 燥 好的材料如图 I A 所 示（K i m e t al.2003) 。

HA-D N A 薄膜

a•风干 HA/pDNA 混合物形成 HA-DNA 薄膜。

b. 将 I O m g A D H 溶解在 I O Oml 8 0 % 的异丙醇中，并将干燥的薄膜在此溶液中浸泡3 〇 m i n ，使之部分重新水化。

c. 加人 1ml EDCI 溶 液（12mg/ml，溶于水中）到上述混合物中，用 1mol/L的H C l 调 节 p H 至 5 启动交联反应。

d. 去除溶液，加 入 100m l 9 0 % 异丙醇，并 反 复 用 9 0 % 异丙醇洗涤薄膜，最后用100% 异丙醇洗涤一次。

e. 风 干 H A - D N A 薄膜。干燥好的薄膜材料如图 I B 所 示（K i m et al.2003)。