微量和特殊标本DNA PCR反应模板的制备

一、血斑标本操作方法

1. 将血斑剪碎，置于试管中；

2. 加1.8ml TES液(含0.15mol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl,pH7.5,1mmol/L EDTA)浸泡10min；

3. 加10% SDS 180μl和蛋白酶K(10U)25μl，50℃过夜；

4. 用等体积的饱和酚和氯仿各抽提两次；

5. 上清液加2.5倍体积的无水冷乙醇沉淀DNA；

6. 70%冷乙醇洗1次；

7. 干燥后，溶于适量TE液中；

8. 取适量样品进行PCR扩增。

二、精液标本操作方法

1. 将精液静置30min，使其液化；

2. 用5×PBS洗3次；

3. 将精子悬浮于25% Percoil液中；

4. 离心，500r/min　5min后，悬浮于1×PBS中；

5. 将精子悬浮于1×PCR缓冲液(含有0.05mg/ml蛋白酶K,20mmol/L DTT 1.7μmol/L SDS)中；

6. 37℃温育1h后，85℃灭活蛋白酶K；

7. 取适量样品进行PCR扩增。

三、绒毛标本操作方法

1. 将绒毛样本离心2min，使样品沉淀于管底；

2. 用缓冲液(100mmol/L NaCl, 10mmol/L Tris-HCl,pH 8.0, 1mmol/L EDTA)洗涤两次；

3. 重悬于50μl裂解液(0.1mol/L NaOH, 2 mol/L NaCl和0.5% SDS)中振荡裂解；

4. 煮沸2min，离心10min去沉淀；

4. 取2.5μl上清进行PCR扩增。

四、羊水标本操作方法

1. 取1.5ml羊水置于离心管中，离心5min；

2. 弃上清，将细胞团用TE缓冲液洗涤1次；

3. 于沉淀细胞中加入50μl裂解液(0.1mol/L NaOH,2mol/L NaCl)，振荡裂解；

4. 煮沸2min，并再次振荡；

5. 离心10min，去细胞碎片；

6. 取2.5μl上清进行PCR扩增。

五、口腔上皮细胞标本操作方法

1. 用15ml生理盐水漱口10s，置液体于试管中；

2. 2000r/min离心10min；

3. 加1ml TES和10%SDS　100μl；

4. 55℃消化2h；

5. 用等体积的饱和酚和氯仿各抽提2次；

6. 预冷的无水乙醇沉淀DNA；

7. 70%无水乙醇洗涤一次；

8. 真空干燥，溶于适量的TE液中

9. 适量样品进行PCR扩增。

六、尿样标本操作方法

1. 将尿样3000r/min离心5min，弃沉淀，取上清2～5μl即可直接进行PCR扩增。

但由于尿液中往往存在DNA聚合酶的抑制物。直接用尿液扩增会产生一定的假阳性。为了避免这种情况,可进行下列处理。

2. 取尿液400μl，3000r/min离心5min；

3. 取上清液，加入10% SDS使终浓度达0.1%，37℃保温30min；

4. 加入等体积的苯酚，充分振荡后，7000r/min离心10min，取上清；

5. 用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)和氯仿/异戊醇(24:1)混合液再同样各抽提一次；

6. 取上清400μl，加入5μl糖原(10mg/ml)，1/10体积的3mol/L NaAC(pH 5.5)和2.5体积的乙醇，-20℃过夜；

7. 12000r/min离心20min弃上清，75%乙醇洗涤两次；

8. 用TE溶解沉淀，取适量样品进行PCR扩增。

七、耳血标本操作方法

1. 血两滴（30～100μl），置微量离心管中，加1ml 1×SSC，4000g离心1min；

2. 弃上清，加1ml双蒸水，混匀，立即加入0.25ml 5×SSC，5000g离心1min；

3. 弃上清，加3mol NaAc(pH5.2)0.2ml，20μl 10%SDS，混匀；

4. 用等体积的饱和酚，氯仿各自抽提两次，上清液加预冷的2.5倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mol NaAc(pH5.2)，沉淀DNA；

5. 70%乙醇洗一次，干燥；

6. 溶于10～20μlTE缓冲液(pH8.0)。