白细胞标本DNA PCR反应模板的制备

方法一

1. 试剂与配制

蛋白酶K：20mg/L 溶于10mmol/L Tris-HCl pH7.5

TE缓冲液（pH7.5 或8.0）

PBS（磷酸盐缓冲液）

钾缓冲液：50mmol/L KCl,10～20mmol/L Tris-Cl，2.5mmol/L MgCl(pH8.3)，1%laureth12 ，0.5% Tween-20，蛋白酶K（100μg/ml）

2.操作方法

① 通过密度梯度离心法，分离1～2ml全血中的单核细胞；

② 用PBS缓冲液洗单核细胞2次，然后计数；

③ 用100μl钾缓冲液悬起部分细胞，使其浓度为5000个/μl；

④ 56℃水浴45min，消化细胞；

⑤ 95℃ 保温10min，灭活蛋白酶K，取10μl上清进行100μl PCR反应。

方法二

1. 试剂与配制

1%SDS，10mmol/L EDTANa₂

玻璃粉悬液（50%水溶液）

乙醇漂洗液：50%乙醇，10mmol/L Tris-Cl（pH7.4），1mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl

2. 操作方法

① 将收集的白细胞(2×10⁵)与50μl含1%SDS的10mmol/L EDTANa₂混匀；

② 再加入150μl 4mol/L NaCl 和5μl玻璃粉悬液（50%水溶液），混匀；

③ 置冰上5min，1000g离心1min；

④ 弃上清，用300μl乙醇漂洗液洗沉淀三次；

⑤ 加入100μl水于结合有玻璃粉的DNA沉淀中，55℃ 保温3min。1000g离心1min，50μl上清即可用于PCR。

方法三

1. 试剂与配制

细胞裂解液：10mmol/L Tris-Cl（pH7.5），10mmol/LMgCl₂，10mmol/LNaCl

白细胞核裂解液（pH8.0）：10mmol/L Tris-Cl（pH8.0），400mmol/LNaCl，2mmol/L EDTA

TE缓冲液（pH7.5 或8.0）

10%SDS

蛋白酶E：10mg/ml 溶于双蒸水中，37℃水浴2hr，储存于-20℃

饱和乙酸钠溶液：将200克结晶乙酸钠（CHCOONa-3H₂0）溶于100ml蒸馏水中，有结晶析出，取上清备用。

3mol乙酸钠（pH5.2）

无水乙醇

70%乙醇

2. 操作方法

① 将20ml细胞裂解液加入到5ml抗凝血中，混匀，1000g离心10min，收集白细胞沉淀，再用10ml细胞裂解液重复一次；

② 加入8ml细胞核裂解液至白细胞沉淀中，混匀，3000g离心10min；

③ 收集沉淀，加入3ml白细胞核裂解液充分混匀；

④ 加250μl蛋白酶E（10mg/ml）和400μl 10%SDS，快速充分混匀；

⑤ 37℃水浴过夜或50℃水浴3hr；

⑥ 加1ml饱和乙酸钠，振摇15s，2000g离心15min；

⑦ 将上清移出，加入1/10体积的3mol乙酸钠（pH5.2），混匀，再加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA；

⑧ 70%乙醇洗2次，TE溶解，4℃保存。