RNA标本PCR反应模板的制备
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一、血液单核细胞RNA制备
1. 用密度梯度法制备血中单核细胞;
2. 取出单核细胞用PBS洗2次,每次300g离心5min;
3. 洗后的单核细胞沉淀用200~400μl含0.5% NP-40的预冷的IHB(0.01% DEPC配制)重新悬起;
4. 离心10sec沉淀细胞核,若有必要,可收集细胞核DNA,但应洗去DEPC;
5. 将上清转至另一离心管中,置37℃保温20min,然后在90℃水浴10min,水浴过程中要保持离心管盖松弛,使降解的DEPC逸出;
6. 高速离心,取5~10μl上清用于RT-PCR。
注意事项
1. 由于DEPC可破坏DNA和RNA,因此,90℃水浴这一步是除去DEPC的关键。
2. 此方法也可用于组织细胞 RNA的提取。
二、哺乳动物组织和细胞RNA制备(SDS-酚-氯仿法)
1. 确定要处理的组织样品的质量;
2. 按每100mg组织0.5ml SDS和1ml的酚或每1×106个培养细胞0.2ml SDS和 0.4ml的酚的比例加入试管中;
3. 将组织样品置于试管中匀浆至少30s;
4. 加入1/10体积的4℃乙酸钠,混匀;
5. 4℃,12,000g离心10min;
6. 小心移出上层(含有RNA)转移至另一试管,加入5份酚和1份氯仿/异戊醇(24:1)的混合物,摇动15sec后重复离心步骤;
7. 水相移至另一离心管中加入1/25体积的冷的5mol/L的NaCl和2倍体积的冷的无水乙醇,混匀置-20℃过夜;
8. 4℃,12,000g离心10min,小心倾去乙醇;
9. 用75%的乙醇清洗RNA,4℃,12,000g离心10min,小心倾去乙醇;
10 用20~50μl去离子水溶解RNA沉淀,-70℃保存。