3 PCR反应模板的制备
丁香园论坛
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PCR反应模板的制备
PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计，酶的质量.模板的制备，在前二者都稳定可行的情况下，PCR模板的制备尤为重要.模板处理方法的选择及操作人员的基 本技能，决定分离模板核酸(DNA或RNA)的质和量及PCR的成败.而提高模板核酸质量的 关键是除去杂质(蛋白质、酶、脂肪等).除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高 模板核酸的产量.
传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组份，溶解细胞膜， 使蛋白质变性，再用蛋白酶K来消化去除蛋白质，尤其是与DNA结合的蛋白质，再用 酚:氯仿抽提，然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸，供PCR实验用.但近几年来也发展了些 简便实用较为有效的标本消化处理方法.亦可满足PCR实验的要求.采用哪种方法消化 处理标本，视PCR实验的目的(是科研还是检测)及环境条件而定.
模板核酸的提取制备方法
(一)蛋白酶K消化裂解法：适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组 织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌 物、尿，粪便等.
1.试剂配制
①蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)
10mmol/LEDTA
150mmol/LNaCL
0.5%SDS
100～200ug/ml蛋白酶K.
②蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，临用时加入消化液中.
2.提取方法:
有些标本、在用蛋白酶K消化前，还需预处理一下，如粪便、分泌物、痰液、组 织块、石蜡包埋组织等，其方法有离心去掉杂质，脱蜡等.
临床标本或经预处理的标本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混匀，55℃1～3小时， 或37℃过夜.加等体积的饱和酚抽提1～2次，再加等体积的氯仿:异戊醇(49:1)抽提一 次，上清加入1/10体积的pH值5.23mmol/L醋酸钠缓冲液，加入2.5倍体积的冰冷无水 乙醇(或加等体积的异丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000转/min离心15min.小心吸 弃或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤1～2次，特别小心的 吸弃或倒掉上清，真空或37℃温箱或室温干燥，加TE缓冲液20ul.溶解后，取3～8ul 用于PCR扩增，或放-20℃保存.
蛋白酶K消化法除上述经典处理法外，亦可在蛋白K消化处理标本，经离心处理 后，吸取上清经95～97℃或煮沸10min灭活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR扩增. 如杂质较多，还可经酚:氯仿抽提后，即可用于PCR反应.此法蛋白质及其它杂质消除 彻底，Taq酶活性不受影响，具有良好的重复性与稳定性.但操作繁复，技术要求高.
(二)直接裂解法:标本(组织细胞，分泌物)加PBS或生理盐水离心洗涤后，加消化 裂解液20～50ul(0.5%NP-40和0.5%吐温-20)，95～98℃，15～30min以裂解病原体， 裂解细胞.然后12000r/min离心5～10min，取上清20～30ul用于PCR扩增.血清标本可 直加等体积的消化液，加热处理离心后PCR扩增.亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解 液，95℃30min消化处理，离心取上清，PCR扩增检测HBV DNA.
(三)碱变性法:取血清20ul，加入1mol/L NaOH 20ul，37℃30min，离心，加 1mol/L HCl 20ul，离心后，取上清5ul，用于PCR扩增.亦有用10ul血清加NaOH至 0.2mol/L，37℃1h，再加HCL中和离心后取上清10ul做PCR，其特异性和敏感性较前法 更好.
(四)煮沸法:经离心洗涤过的组织细胞，分泌物及血液标本，加适量无菌蒸馏水或PBS，混匀 后，100℃煮沸10～15min，14000r/min 10min，取上清做PCR.
(五)碘化钠法:取组织细胞及抗凝血液10～100ul，加等体积的6MNaI，反复轻混 20s，加等体积氯仿:异戊醇(49:1)振匀后，离心取上清加0.6体积的异丙醇，混匀后 置室温3min.14000r/min 10min，沉淀加10～100ul，TE溶解，取5～10ul做PCR，亦有 用100ul血清加裂解液300ul(6M NaI，0.5%十二烷基肌酸钠，10ug糖原，26mmol/L pH8.0 Tris-HCL，13mmol/LEDTA)混匀后，60℃15min，加等体积异丙醇，离心沉定 后，加TE液用于PCR扩增，其产量和质量较高.
(六)异硫氰酸胍法
此法主要用于RNA的提取.标本为组织细胞及血清等.
1.异硫氰酸胍消化液
异硫氰酸胍4mol/L
柠檬酸钠(PH7.0)25mmol/L
十二烷基肌酸钠0.5%
β-巯基乙醇0.1mol/L
2.消化方法:用50～100ul细胞悬液及血清，加等体积的异硫氰酸胍消化液振混匀 后，或65℃1小时，或室温放置数分钟，然后加1/10体积的3mmol/L pH5.2的醋酸钠缓 冲液，再加等体积的酚:氯仿，用力振摇约10s，10000r/min，离心5min，取上清加等 体积异丙醇-20℃放置3h后，14000r/min离心15min，沉定用75%冰冷乙醇离心洗涤1～ 2次，真空干燥，沉淀用TE缓冲液溶解即可用于逆转录PCR扩增，或放-20℃保存.
其它消化处理标本提模板核酸的方法有①异硫氰酸胍一二氧化硅法②异硫氰酸胍 -玻璃粉法.③Chelex-100法.④全血直接扩增法⑤尿素消化裂解法.各有千秋，可根据 情况选用.
PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计，酶的质量.模板的制备，在前二者都稳定可行的情况下，PCR模板的制备尤为重要.模板处理方法的选择及操作人员的基 本技能，决定分离模板核酸(DNA或RNA)的质和量及PCR的成败.而提高模板核酸质量的 关键是除去杂质(蛋白质、酶、脂肪等).除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高 模板核酸的产量.
传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组份，溶解细胞膜， 使蛋白质变性，再用蛋白酶K来消化去除蛋白质，尤其是与DNA结合的蛋白质，再用 酚:氯仿抽提，然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸，供PCR实验用.但近几年来也发展了些 简便实用较为有效的标本消化处理方法.亦可满足PCR实验的要求.采用哪种方法消化 处理标本，视PCR实验的目的(是科研还是检测)及环境条件而定.
模板核酸的提取制备方法
(一)蛋白酶K消化裂解法：适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组 织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌 物、尿，粪便等.
1.试剂配制
①蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)
10mmol/LEDTA
150mmol/LNaCL
0.5%SDS
100～200ug/ml蛋白酶K.
②蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，临用时加入消化液中.
2.提取方法:
有些标本、在用蛋白酶K消化前，还需预处理一下，如粪便、分泌物、痰液、组 织块、石蜡包埋组织等，其方法有离心去掉杂质，脱蜡等.
临床标本或经预处理的标本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混匀，55℃1～3小时， 或37℃过夜.加等体积的饱和酚抽提1～2次，再加等体积的氯仿:异戊醇(49:1)抽提一 次，上清加入1/10体积的pH值5.23mmol/L醋酸钠缓冲液，加入2.5倍体积的冰冷无水 乙醇(或加等体积的异丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000转/min离心15min.小心吸 弃或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤1～2次，特别小心的 吸弃或倒掉上清，真空或37℃温箱或室温干燥，加TE缓冲液20ul.溶解后，取3～8ul 用于PCR扩增，或放-20℃保存.
蛋白酶K消化法除上述经典处理法外，亦可在蛋白K消化处理标本，经离心处理 后，吸取上清经95～97℃或煮沸10min灭活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR扩增. 如杂质较多，还可经酚:氯仿抽提后，即可用于PCR反应.此法蛋白质及其它杂质消除 彻底，Taq酶活性不受影响，具有良好的重复性与稳定性.但操作繁复，技术要求高.
(二)直接裂解法:标本(组织细胞，分泌物)加PBS或生理盐水离心洗涤后，加消化 裂解液20～50ul(0.5%NP-40和0.5%吐温-20)，95～98℃，15～30min以裂解病原体， 裂解细胞.然后12000r/min离心5～10min，取上清20～30ul用于PCR扩增.血清标本可 直加等体积的消化液，加热处理离心后PCR扩增.亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解 液，95℃30min消化处理，离心取上清，PCR扩增检测HBV DNA.
(三)碱变性法:取血清20ul，加入1mol/L NaOH 20ul，37℃30min，离心，加 1mol/L HCl 20ul，离心后，取上清5ul，用于PCR扩增.亦有用10ul血清加NaOH至 0.2mol/L，37℃1h，再加HCL中和离心后取上清10ul做PCR，其特异性和敏感性较前法 更好.
(四)煮沸法:经离心洗涤过的组织细胞，分泌物及血液标本，加适量无菌蒸馏水或PBS，混匀 后，100℃煮沸10～15min，14000r/min 10min，取上清做PCR.
(五)碘化钠法:取组织细胞及抗凝血液10～100ul，加等体积的6MNaI，反复轻混 20s，加等体积氯仿:异戊醇(49:1)振匀后，离心取上清加0.6体积的异丙醇，混匀后 置室温3min.14000r/min 10min，沉淀加10～100ul，TE溶解，取5～10ul做PCR，亦有 用100ul血清加裂解液300ul(6M NaI，0.5%十二烷基肌酸钠，10ug糖原，26mmol/L pH8.0 Tris-HCL，13mmol/LEDTA)混匀后，60℃15min，加等体积异丙醇，离心沉定 后，加TE液用于PCR扩增，其产量和质量较高.
(六)异硫氰酸胍法
此法主要用于RNA的提取.标本为组织细胞及血清等.
1.异硫氰酸胍消化液
异硫氰酸胍4mol/L
柠檬酸钠(PH7.0)25mmol/L
十二烷基肌酸钠0.5%
β-巯基乙醇0.1mol/L
2.消化方法:用50～100ul细胞悬液及血清，加等体积的异硫氰酸胍消化液振混匀 后，或65℃1小时，或室温放置数分钟，然后加1/10体积的3mmol/L pH5.2的醋酸钠缓 冲液，再加等体积的酚:氯仿，用力振摇约10s，10000r/min，离心5min，取上清加等 体积异丙醇-20℃放置3h后，14000r/min离心15min，沉定用75%冰冷乙醇离心洗涤1～ 2次，真空干燥，沉淀用TE缓冲液溶解即可用于逆转录PCR扩增，或放-20℃保存.
其它消化处理标本提模板核酸的方法有①异硫氰酸胍一二氧化硅法②异硫氰酸胍 -玻璃粉法.③Chelex-100法.④全血直接扩增法⑤尿素消化裂解法.各有千秋，可根据 情况选用.
