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PCR技术:PCR反应模板的制备

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PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计,酶的质量.模板的制备,在前二者都稳定可行的情况下,PCR模板的制备尤为重要.模板处理方法的选择及操作人员的基 本技能,决定分离模板核酸(DNA或RNA)的质和量及PCR的成败.而提高模板核酸质量的 关键是除去杂质(蛋白质、酶、脂肪等).除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子,提高 模板核酸的产量.

传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组份,溶解细胞膜, 使蛋白质变性,再用蛋白酶K来消化去除蛋白质。

尤其是与DNA结合的蛋白质,再用 酚:氯仿抽提,然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸,供PCR实验用.但近几年来也发展了些 简便实用较为有效的标本消化处理方法.亦可满足PCR实验的要求.采用哪种方法消化 处理标本,视PCR实验的目的(是科研还是检测)及环境条件而定.

模板核酸的提取制备方法

(一)蛋白酶K消化裂解法:适用于所有标本的消化处理,尤以DNA样品为佳.如组 织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌 物、尿,粪便等.

1.试剂配制

①蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)

  10mmol/LEDTA

  150mmol/LNaCL

  0.5%SDS

  100~200ug/ml蛋白酶K.

②蛋白酶K最好用水配成20mg/ml,临用时加入消化液中.

2.提取方法

有些标本、在用蛋白酶K消化前,还需预处理一下,如粪便、分泌物、痰液、组 织块、石蜡包埋组织等,其方法有离心去掉杂质,脱蜡等.

临床标本或经预处理的标本加蛋白酶K裂解液50~100ul.混匀,55℃1~3小时, 或37℃过夜.加等体积的饱和酚抽提1~2次,再加等体积的氯仿:异戊醇(49:1)抽提一 次,上清加入1/10体积的pH值5.23mmol/L醋酸钠缓冲液,加入2.5倍体积的冰冷无水 乙醇(或加等体积的异丙醇)-20℃放置至少3h.

取出后14000转/min离心15min.小心吸 弃或倒出上清,沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤1~2次,特别小心的 吸弃或倒掉上清,真空或37℃温箱或室温干燥,加TE缓冲液20ul.溶解后,取3~8ul 用于PCR扩增,或放-20℃保存.

蛋白酶K消化法除上述经典处理法外,亦可在蛋白K消化处理标本,经离心处理 后,吸取上清经95~97℃或煮沸10min灭活蛋白酶K后,直接作核酸模板用于PCR扩增. 如杂质较多,还可经酚:氯仿抽提后,即可用于PCR反应.此法蛋白质及其它杂质消除 彻底,Taq酶活性不受影响,具有良好的重复性与稳定性.但操作繁复,技术要求高.

(二)直接裂解法:标本(组织细胞,分泌物)加PBS或生理盐水离心洗涤后,加消化 裂解液20~50ul(0.5%NP-40和0.5%吐温-20),95~98℃,15~30min以裂解病原体, 裂解细胞.然后12000r/min离心5~10min,取上清20~30ul用于PCR扩增.血清标本可 直加等体积的消化液,加热处理离心后PCR扩增.

亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解 液,95℃30min消化处理,离心取上清,PCR扩增检测HBV DNA.

(三)碱变性法:取血清20ul,加入1mol/L NaOH 20ul,37℃30min,离心,加 1mol/L HCl 20ul,离心后,取上清5ul,用于PCR扩增.亦有用10ul血清加NaOH至 0.2mol/L,37℃1h,再加HCL中和离心后取上清10ul做PCR,其特异性和敏感性较前法 更好.

(四)煮沸法:经离心洗涤过的组织细胞,分泌物及血液标本,加适量无菌蒸馏水或PBS,混匀 后,100℃煮沸10~15min,14000r/min 10min,取上清做PCR.

(五)碘化钠法:取组织细胞及抗凝血液10~100ul,加等体积的6MNaI,反复轻混 20s,加等体积氯仿:异戊醇(49:1)振匀后,离心取上清加0.6体积的异丙醇,混匀后 置室温3min.14000r/min 10min,沉淀加10~100ul,TE溶解,取5~10ul做PCR。

亦有 用100ul血清加裂解液300ul(6M NaI,0.5%十二烷基肌酸钠,10ug糖原,26mmol/L pH8.0 Tris-HCL,13mmol/LEDTA)混匀后,60℃15min,加等体积异丙醇,离心沉定 后,加TE液用于PCR扩增,其产量和质量较高.

(六)异硫氰酸胍法

此法主要用于RNA的提取.标本为组织细胞及血清等.

1.异硫氰酸胍消化液

  异硫氰酸胍4mol/L

  柠檬酸钠(PH7.0)25mmol/L

  十二烷基肌酸钠0.5%

  β-巯基乙醇0.1mol/L

2.消化方法:用50~100ul细胞悬液及血清,加等体积的异硫氰酸胍消化液振混匀 后,或65℃1小时,或室温放置数分钟,然后加1/10体积的3mmol/L pH5.2的醋酸钠缓 冲液,再加等体积的酚:氯仿,用力振摇约10s,10000r/min,离心5min取上清。

加等体积异丙醇-20℃放置3h后,14000r/min离心15min,沉定用75%冰冷乙醇离心洗涤1~ 2次,真空干燥,沉淀用TE缓冲液溶解即可用于逆转录PCR扩增,或放-20℃保存.

其它消化处理标本提模板核酸的方法有①异硫氰酸胍一二氧化硅法②异硫氰酸胍 -玻璃粉法.③Chelex-100法.④全血直接扩增法⑤尿素消化裂解法.各有千秋,可根据 情况选用。

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