微量DNA的纯化
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1.对于微量DNA样品溶液(如100ml以下),应预先将DNA溶液以TE或无菌水稀释至一定体积。以减少第5步中的DNA损失。
2.加入等体积的酚:氯仿:异戊醇[1](25:24:1)。
3.剧烈振荡管中内容物,将水相和有机相充分混匀,使之成为乳浊液。
4.室温下静置以初步分层。再用离心机于室温以10000rpm离心至少5分钟以上,使无机相与有机相充分分开。
5.用剪去尖头的微量移液器枪头[2]小心移出水相于一干净离心管中(不要扰动界面上的蛋白质层),弃去有机相、两相界面层及接近两相界面层的水相。
6. 重复步骤2-5直至两相界面上看不到蛋白质层。
7.加入等体积的氯仿并重复步骤2-5。
8.加入1/10体积乙酸钠(3.0mol/L,pH 5.2),再加入等体积的异丙醇,颠倒混匀。
9.用离心机于室温以10000rpm离心10分钟使核酸沉淀[3]。倾掉上清液。
10.加入1/2离心管体积的75%乙醇洗涤DNA沉淀[4]10分钟。
11.10000rpm离心2分钟。使DNA沉淀紧贴管底。
12.倾掉上清液,将离心管倒置于纸巾上使残留液体挥发至干。
13.用适当体积的TE(pH8.0)缓冲液溶解DNA沉淀,用缓冲液充分洗管壁。-20℃贮藏。
[1]任何含有苯酚或/和氯仿的试剂都应使用巴斯德吸管或玻璃滴管,切忌使用微量移液器,因苯酚和氯仿(尤其是后者)都对微量移液器具有强腐蚀性。
[2]使用剪去尖头的微量移液器枪头以避免水流搅动界面。
[3]纯化良好的DNA沉淀于离心管底,无色透明,肉眼不可见。
[4]只需浸泡静置,不用将DNA沉淀重新悬浮。