DNA的纯化浓缩与定量

实验目的

将复杂的细胞分子混合物加入有机溶媒萃取以除去蛋白质及其它成分，就可以纯化DNA。一般常用酚及氯仿(phenol/chloroform)可使蛋白质变性(denaturaion)的特性来进行萃取的步骤，DNA和RNA不溶于有机溶媒中，而溶于水层。另外，分子选殖(molecular cloning)常利用洋菜胶(agarose)来分离不同大小的DNA片段或用以纯化DNA。

核酸定量可利用核酸会吸收260及280 nm波长的UV光，而且可与荧光染剂ethidium bromide (EtBr)键结，这些物理特性即一般定量DNA的的基本原理。此外亦可藉由UV光的吸收来评估DNA的纯度，若纯化DNA的量足够时，可用光谱分析法定量，当DNA量少或不纯时，才用EtBr键结方法。(注意：EtBr为致癌剂，操作时务必带手套，并禁止戴手套的手到处乱摸!)

溶媒萃取法

1.仪器用具：

(1).桌上型离心机

(2).37℃恒温箱

(3).排烟柜

2.药品及试剂：

(1).phenol/chloroform = 1：1

(2).chloroform/isoamylalcohol = 24：1

(3).RNase A：1mg/ml (100 加热30分钟去除DNase活性)

(4).100% ethanol

(5).TE buffer

3.方法步骤：

(1)由实验1中小量制备的DNA样品，加入RNase A以去除RNA，其终浓度为10-20 mg/ml。

(2)加入50 ml TE buffer混合均匀。

(3)加入100 ml phenol (注意! phenol对皮肤具腐蚀性药品，务必带上手套并在排烟柜中操作)，混合均匀使溶液形成混浊状，这样可以避免震荡及搅拌时所产生的拉力将DNA弄断。

(4)12,000 rpm离心20秒，小心用pipetman把上层液取出到另一离心管。

(5)加入100 ml phenol及100 ml chloroform以萃取刚才收集到的上层液，重复步骤4。

(6)加入200 ml chloroform萃取上层液，并重复步骤4。

浓缩质体DNA

1.仪器用具：

(1).桌上型离心机

(2).真空干燥器

2.药品及试剂：

(1).3 M sodium acetate (NaOAc),pH 5.2

(2).100% ethanol

(3).TE buffer

3.方法步骤:

(1)加入1/10体积的sodium acetate于DNA溶液中，使其最终浓度为0.3 M。

(2)加入2.5倍体积100% Ethanol (EtOH)混合后，置于-20 中30~60分钟(若DNA小于1kb或量少于100 ng/ml，应把溶液放在-70 下2小时，若DNA小于200 bp时，加入10 mM MgCl2 有助于DNA回收。)

(3)12,000 rpm离心10分钟，倒掉上清液，置于真空干燥器10分钟。

(4)加50 ml TE buffer or water，再次悬浮DNA，保存样品DNA于4 。

胶体核酸回收法

1.仪器用具：

(1).桌上型离心机

(2).干浴器

2.药品及试剂：

QIAqiuck gel extraction kit (Qiagen)或其它厂牌。

3.方法步骤：

(1）质体DNA经限制酶切割后，以含EtBr之1% agarose gel进行电泳，电泳后以长波长UV灯观察DNA片段所在位置，并以干净刀片将之切下，尽可能切越小越好。

(2）取一微量离心管，秤重后再将切下的胶体置于管内再秤重，以估计胶体重，每管胶体不超过400 mg，加入3倍体积之QG buffer (即每100 mg胶体加入300 ml QG buffer 。

(3）置入50 干浴器(内放水)水浴10分钟，期间可每隔2~3分钟以手指轻弹管壁以加速胶体完全溶解。

(4）加入胶体一倍体积之异丙醇混合均匀，此时溶液为黄色(为原本QG buffer的颜色)。

(5）将QIAquick spin column置于2 ml离心管中，加入上一步的gel solution，12,000 rpm 离心一分钟。（此spin column之最大容量为800 ml，若样品体积超过800 ml，则需分次加入）。

(6）离心后，倒掉离心管流出液，将spin column置回原离心管中，加入750 ml PE buffer，静置5分钟。

(7）13,000 rpm离心1分钟，到掉流出液，将spin column置于原离心管中，重复13,000 rpm离心1分钟。

(8）将spin column置于另一个干净的1.5 ml离心管中，加入10~15ml EB buffer或水到silica membrane上，静置1分钟。

(9）13,000 rpm离心1分钟，丢弃spin column，此溶液即为浓缩DNA供下一个定量或接合反应（ligation）。

DNA之定量及纯度测定

1.仪器用具：

(1).UV/VIS spectrophotometer (紫外线/可见光分光光度计)

(2).UV灯箱

(3).拍立得（polaroid）相机或数字影像分析系统

2.材料：

小量制备DNA质体、DNA片段、PCR产物或oligonucleotide

3.Spectrophotometer定量法：

测定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下：

(1).ds DNA (double stranded DNA)= 50 mg/ml

(2).ss DNA (single stranded DNA)= 40 mg/ml

(3).oligonucleotide = 33 mg/ml

4.Ethidium bromide定量法：

利用一系列不同浓度的DNA标准溶液（0、2.5、5、10、20、30、40、50 ng/ml），或已知浓度的DNA marker，和未知浓度DNA样品一起进行琼胶（洋菜胶）电泳，以EtBr染色后，于UV灯箱上照相，比较标准浓度及未知浓度的亮度，来求取DNA 的含量。

5.测定DNA纯度：

测定样品在260 nm及280 nm吸光值之比较，由数值大小判定DNA的纯度。OD₂₆₀ /OD₂₈₀ ＝1.8表示DNA的纯度高，若数值<<1.8，表示纯度低，故单由OD₂₆₀ 测得的DNA含量较不可信。