DNA纯化浓缩定量
丁香园论坛
1825
目的
将复杂的细胞分子混合物加入有机溶媒，除去蛋白质及其它成分，就可以纯化DNA。一般常用酚及氯仿(phenol/chloroform)可使蛋白质变性(denaturaion)的特性来进行萃取的步骤，DNA和RNA不溶于有机溶媒中，而溶于水层。另外，分子选殖(molecular cloning)常利用洋菜胶(agarose)来分离不同大小的DNA片段或用以纯化DNA。
DNA经限制酶反应、自胶体中溶离或任何酵素反应后，常常体积遽增，为了浓缩已经纯化的DNA，常利用酒精沉淀法来制备，经过离心便可收集到DNA，然后再溶于少量的缓冲溶液中即可。酒精沉淀法另一方面可去除phenol/chloroform，以免抑制选殖实验中限制酶或其它酵素的作用。坊间的分子生物厂商有spin column的方式来快速的(5分钟)浓缩质体DNA，故可依实验的目的及经费的状况而做合适的选择。
最后，有几种方式可以将核算定量，核酸会吸收260及280 nm波长的UV光，而且可与萤光染剂ethidium bromide (EtBr)键结，这些物理特性即一般定量DNA的的基本原理。此外亦可藉由UV光的吸收来评估DNA的纯度，若纯化DNA的量足够时，可用光谱分析法定量，当DNA量少或不纯时，才用EtBr键结方法。(注意：EtBr为致癌剂，操作时务必带手套，并禁止戴手套的手到处乱摸!)
II.溶媒萃取法
1.仪器用具：
a. 桌上型离心机
b. 37 恒温箱
c. 排烟柜
2.药品及试剂：
a. phenol/chloroform = 1：1
b. chloroform/isoamylalcohol = 24：1
c. RNase A：1mg/ml (100 加热30分钟去除DNase活性)
d. 100% ethanol
e. TE buffer
3.方法步骤：
1) 由实验1中小量制备的DNA样品，加入RNase A以去除RNA，其终浓度为10-20 mg/ml。
2) 加入50 ml TE buffer混合均匀。
3) 加入100 ml phenol (注意! phenol对皮肤具腐蚀性药品，务必带上手套并在排烟柜中操作)，混合均匀使溶液形成混浊状，这样可以避免震荡及搅拌时所产生的拉力将DNA弄断。
4) 12,000 rpm离心20秒，小心用pipetman把上层液取出到另一离心管。
5) 加入100 ml phenol及100 ml chloroform以萃取刚才收集到的上层液，重复步骤4。
6) 加入200 ml chloroform萃取上层液，并重复步骤4。
III.浓缩质体DNA
1. 仪器用具：
a. 桌上型离心机
b. 真空干燥器
2. 药品及试剂：
a. 3 M sodium acetate (NaOAc), pH 5.2
b. 100% ethanol
c. TE buffer
3. 方法步骤:
1) 加入1/10体积的sodium acetate于DNA溶液中，使其最终浓度为0.3 M。
2) 加入2.5倍体积100% Ethanol (EtOH)混合后，置于-20 中30~60分钟(若DNA小于1kb或量少于100 ng/ml，应把溶液放在-70 下2小时，若DNA小于200 bp时，加入10 mM MgCl2有助于DNA回收。)
3) 12,000 rpm离心10分钟，倒掉上清液，置于真空干燥器10分钟。
4) 加50 ml TE buffer or water，再次悬浮DNA，保存样品DNA于4 。
IV.Spin column浓缩法
1.仪器用具：
a. 桌上型离心机
b. 干浴器
2.药品及试剂：
QIAqiuck gel extraction kit (Qiagen)或其它厂牌。
3.方法步骤：
1） pT7-6 and pINDlacZ 经EcoRI及HindIII限制酶作用后，以含EtBr之1% agarose gel进行电泳，电泳后以长波长UV灯观察DNA片段所在位置，并以干净刀片将之切下，尽可能切越小越好。
2） 取一微量离心管，秤重后再将切下的胶体置于管内再秤重，以估计胶体重，每管胶体不超过400 mg，加入3倍体积之QG buffer (即每100 mg胶体加入300 ml QG buffer 。
3） 置入50 干浴器(内放水)水浴10分钟，期间可每隔2~3分钟以手指轻弹管壁以加速胶体完全溶解。
4） 加入胶体一倍体积之异丙醇混合均匀，此时溶液为黄色(为原本QG buffer的颜色)。
5） 将QIAquick spin column置于2 ml离心管中，加入上一步的gel solution，12,000 rpm 离心一分钟。（此spin column之最大容量为800 ml，若样品体积超过800 ml，则需分次加入）。
6） 离心后，倒掉离心管流出液，将spin column置回原离心管中，加入750 ml PE buffer，静置5分钟。
7） 13,000 rpm离心1分钟，到掉流出液，将spin column置于原离心管中，重复13,000 rpm离心1分钟。
8） 将spin column置于另一个干净的1.5 ml离心管中，加入10~15ml EB buffer或水到silica membrane上，静置1分钟。
9） 13,000 rpm离心1分钟，丢弃spin column，此溶液即为浓缩DNA供下一个定量或接合反应（ligation）。
V.DNA之定量及纯度测定
1.仪器用具：
a. UV/VIS spectrophotometer (紫外线/可见光分光光度计)
b. UV灯箱
c. 拍立得（polaroid）相机或数字元影像分析系统
2.材料：
小量制备DNA质体、DNA片段、PCR产物或oligonucleotide
3.Spectrophotometer定量法：
测定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下：
a. ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/ml
b. ss DNA (single stranded DNA) = 40 mg/ml
c. oligonucleotide = 33 mg/ml
4.Ethidium bromide定量法：
利用一系列不同浓度的DNA标准溶液（0、2.5、5、10、20、30、40、50 ng/ml），或已知浓度的DNA marker，和未知浓度DNA样品一起进行琼胶（洋菜胶）电泳，以EtBr染色后，于UV灯箱上照相，比较标准浓度及未知浓度的亮度，来求取DNA 的含量。
5.测定DNA纯度：
测定样品在260 nm及280 nm吸光值之比较，由数值大小判定DNA的纯度。OD260/OD280＝1.8表示DNA的纯度高，若数值<<1.8，表示纯度低，故单由OD260测得的DNA含量较不可信。
将复杂的细胞分子混合物加入有机溶媒，除去蛋白质及其它成分，就可以纯化DNA。一般常用酚及氯仿(phenol/chloroform)可使蛋白质变性(denaturaion)的特性来进行萃取的步骤，DNA和RNA不溶于有机溶媒中，而溶于水层。另外，分子选殖(molecular cloning)常利用洋菜胶(agarose)来分离不同大小的DNA片段或用以纯化DNA。
DNA经限制酶反应、自胶体中溶离或任何酵素反应后，常常体积遽增，为了浓缩已经纯化的DNA，常利用酒精沉淀法来制备，经过离心便可收集到DNA，然后再溶于少量的缓冲溶液中即可。酒精沉淀法另一方面可去除phenol/chloroform，以免抑制选殖实验中限制酶或其它酵素的作用。坊间的分子生物厂商有spin column的方式来快速的(5分钟)浓缩质体DNA，故可依实验的目的及经费的状况而做合适的选择。
最后，有几种方式可以将核算定量，核酸会吸收260及280 nm波长的UV光，而且可与萤光染剂ethidium bromide (EtBr)键结，这些物理特性即一般定量DNA的的基本原理。此外亦可藉由UV光的吸收来评估DNA的纯度，若纯化DNA的量足够时，可用光谱分析法定量，当DNA量少或不纯时，才用EtBr键结方法。(注意：EtBr为致癌剂，操作时务必带手套，并禁止戴手套的手到处乱摸!)
II.溶媒萃取法
1.仪器用具：
a. 桌上型离心机
b. 37 恒温箱
c. 排烟柜
2.药品及试剂：
a. phenol/chloroform = 1：1
b. chloroform/isoamylalcohol = 24：1
c. RNase A：1mg/ml (100 加热30分钟去除DNase活性)
d. 100% ethanol
e. TE buffer
3.方法步骤：
1) 由实验1中小量制备的DNA样品，加入RNase A以去除RNA，其终浓度为10-20 mg/ml。
2) 加入50 ml TE buffer混合均匀。
3) 加入100 ml phenol (注意! phenol对皮肤具腐蚀性药品，务必带上手套并在排烟柜中操作)，混合均匀使溶液形成混浊状，这样可以避免震荡及搅拌时所产生的拉力将DNA弄断。
4) 12,000 rpm离心20秒，小心用pipetman把上层液取出到另一离心管。
5) 加入100 ml phenol及100 ml chloroform以萃取刚才收集到的上层液，重复步骤4。
6) 加入200 ml chloroform萃取上层液，并重复步骤4。
III.浓缩质体DNA
1. 仪器用具：
a. 桌上型离心机
b. 真空干燥器
2. 药品及试剂：
a. 3 M sodium acetate (NaOAc), pH 5.2
b. 100% ethanol
c. TE buffer
3. 方法步骤:
1) 加入1/10体积的sodium acetate于DNA溶液中，使其最终浓度为0.3 M。
2) 加入2.5倍体积100% Ethanol (EtOH)混合后，置于-20 中30~60分钟(若DNA小于1kb或量少于100 ng/ml，应把溶液放在-70 下2小时，若DNA小于200 bp时，加入10 mM MgCl2有助于DNA回收。)
3) 12,000 rpm离心10分钟，倒掉上清液，置于真空干燥器10分钟。
4) 加50 ml TE buffer or water，再次悬浮DNA，保存样品DNA于4 。
IV.Spin column浓缩法
1.仪器用具：
a. 桌上型离心机
b. 干浴器
2.药品及试剂：
QIAqiuck gel extraction kit (Qiagen)或其它厂牌。
3.方法步骤：
1） pT7-6 and pINDlacZ 经EcoRI及HindIII限制酶作用后，以含EtBr之1% agarose gel进行电泳，电泳后以长波长UV灯观察DNA片段所在位置，并以干净刀片将之切下，尽可能切越小越好。
2） 取一微量离心管，秤重后再将切下的胶体置于管内再秤重，以估计胶体重，每管胶体不超过400 mg，加入3倍体积之QG buffer (即每100 mg胶体加入300 ml QG buffer 。
3） 置入50 干浴器(内放水)水浴10分钟，期间可每隔2~3分钟以手指轻弹管壁以加速胶体完全溶解。
4） 加入胶体一倍体积之异丙醇混合均匀，此时溶液为黄色(为原本QG buffer的颜色)。
5） 将QIAquick spin column置于2 ml离心管中，加入上一步的gel solution，12,000 rpm 离心一分钟。（此spin column之最大容量为800 ml，若样品体积超过800 ml，则需分次加入）。
6） 离心后，倒掉离心管流出液，将spin column置回原离心管中，加入750 ml PE buffer，静置5分钟。
7） 13,000 rpm离心1分钟，到掉流出液，将spin column置于原离心管中，重复13,000 rpm离心1分钟。
8） 将spin column置于另一个干净的1.5 ml离心管中，加入10~15ml EB buffer或水到silica membrane上，静置1分钟。
9） 13,000 rpm离心1分钟，丢弃spin column，此溶液即为浓缩DNA供下一个定量或接合反应（ligation）。
V.DNA之定量及纯度测定
1.仪器用具：
a. UV/VIS spectrophotometer (紫外线/可见光分光光度计)
b. UV灯箱
c. 拍立得（polaroid）相机或数字元影像分析系统
2.材料：
小量制备DNA质体、DNA片段、PCR产物或oligonucleotide
3.Spectrophotometer定量法：
测定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下：
a. ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/ml
b. ss DNA (single stranded DNA) = 40 mg/ml
c. oligonucleotide = 33 mg/ml
4.Ethidium bromide定量法：
利用一系列不同浓度的DNA标准溶液（0、2.5、5、10、20、30、40、50 ng/ml），或已知浓度的DNA marker，和未知浓度DNA样品一起进行琼胶（洋菜胶）电泳，以EtBr染色后，于UV灯箱上照相，比较标准浓度及未知浓度的亮度，来求取DNA 的含量。
5.测定DNA纯度：
测定样品在260 nm及280 nm吸光值之比较，由数值大小判定DNA的纯度。OD260/OD280＝1.8表示DNA的纯度高，若数值<<1.8，表示纯度低，故单由OD260测得的DNA含量较不可信。
