SDS碱裂解法制备质粒DNA（大量制备）
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原理
用碱和 SDS 处理可以从大规模（500 ml）的细菌培养物中分离质粒 DNA，所获得的质粒则可通过柱层析或 CsCl-溴化乙锭梯度离心进一步纯化。
材料与仪器
碱裂解液 抗生素 乙酵 酚 氯仿 STE TE
LB、YT 或 Terrific 培养液
LB、YT 或 Terrific 培养液
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
(1) 碱裂解液Ⅰ
50 mmol/L 葡萄糖；25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
溶液Ⅰ一次可配制 100 ml，在 15 psi（1.05 kg/cm2）压力下蒸汽灭菌 15 min，保存于 4℃。
若欲用柱层析进一步纯化所制备的质粒 DNA，无菌的碱裂解液Ⅰ在使用前可补充以适当体积的去 DNA 酶的 RNA 酶 A（胰 RNA 酶）（20 mg/ml），使之终浓度为 100 μg/ml，若欲用其他的方法纯化 DNA，则不推荐在此步骤添加 RNA 酶。
(2) 碱裂解液Ⅱ
0.2 N NaOH（从 10 N 贮存液中现用现稀释）；1%（m/V）SDS。
溶液Ⅱ要现用现配，室温下使用。
(3) 碱裂解液Ⅲ
5 mol/L 乙酸钾 60.0 ml；冰乙酸 11.5 ml；H2O 28.5 ml。
所配成的溶液中钾的浓度为 3 mol/L，乙酸根的浓度为 5 mol/L。保存于 4℃，用时置于冰浴中。
(4) 用于筛选质粒的抗生素
(5) 氯霉素（34 mg/ml）
(6) 乙醇
(7) 异丙醇
(8) STE
(9) TE（pH 8.0）
2. 酶和缓冲液
(1) 溶菌酶（10 mg/ml）
(2) 限制性内切核酸酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶
4. 培养基
LB、YT 或 Terrific 培养液
5. 离心机和转头
Sorvall CSA 转头或与之相当的转头。
二、方法
1. 细胞的制备
(1) 挑取转化细菌的单菌落（或用 0.1~1.0 ml 单菌落的培养物），接种到 30 ml 含适当抗生素的培养基（LB、YT 或 Terrific 培养液）中。
为了确保培养物通气良好：试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大 4 倍；试管不宜盖得过紧；应在剧烈振摇下温育。
(2) 在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期（OD600 约为 0.6）。
(3) 在含 500 ml LB、YT 或 Terrific 培养液（预热到 37℃）及适当抗生素的烧瓶（2 L）中接种 25 ml 对数生长期晚期的菌液。将此培养液在 37℃ 剧烈振摇（300 r/min）培养约 2.5 h。
最后菌液的 OD600 值应约为 0.4。由于不用菌株的生长速度不同，可稍微延长或缩短培养时间，使最终的 OD 值为 0.4。
(4) 若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒，在培养液中添加 2.5 ml 浓度为 34 mg/ml 的氯霉素，使其终浓度为 170 μg/ml。
重要：对于高拷贝数的质粒，不必添加氯霉素。
(5) 于 37℃，以 300 r/min 剧烈振荡再培养 12~16 h。
(6) 取部分菌液（1~2 ml）到离心管中，4℃ 贮存。于 4℃，以 2700 g（对于 Sorvall GSA 转子是 4100 r/min）离心 15 min 以收集余下的近 500 ml 培养物。弃上清，倒置离心管使残余的上清流出。
(7) 用 200 ml 冰预冷的 STE 重悬细菌沉淀，按步骤 6 所述重新收集细菌并贮存于 -20℃。
(8) 用步骤 6 中贮存的 1~2 ml 菌液提取质粒（可使用方案 1 或 4 中的任一种方法），采用酶切和琼脂糖电泳分析此小量制备质粒，以确定大量培养菌液中正确的质粒已得以扩增。
设置这种对照可能看上去有点过于谨慎，然而它可以避免发生某些可能难以挽回的、浪费大量时间的错误。
2. 细胞的裂解
(1) 将步骤 7 中冻存的细菌在室温下放置 5~10 min 使其解冻后，用 18 ml (10 ml）碱裂解液Ⅰ重悬。
只有步骤 4 中使用了氯霉素的菌液才应参照括号中的体积数。
(2) 加 2 ml ( 1 ml）新配置的 10 mg/ml 溶菌酶。
(3) 加 40 ml（20 ml）新配置的碱裂解液Ⅱ。盖上离心管盖，轻轻顛倒数次，彻底混匀，室温下放置 5~10 min。
延长超螺旋 DNA 暴露于碱的时间会使其不可逆变性（Vinograd and Lebowitz 1996），所产生的环状卷曲 DNA 不能被限制酶切割，而且它在琼脂糖电泳中的迁移率为正常超螺旋 DNA 的两倍，难以被溴化乙锭染色。从细菌中用碱裂解法提质粒时可能会看到微量的这种 DNA。
(4) 加 20 ml（15 ml）冰预冷的碱裂解液Ⅲ。盖上离心管盖，轻轻地但完全地振荡混匀几次（此时应不再有分离的两个液相）。将离心管在冰上放置 10 min。
在放置过程中会出现由染色体 DNA、高分子质量 RNA、钾离子/SDS/蛋白质/细胞壁复含物一起形成的乳白色沉淀。在碱裂解液Ⅲ中最好使用醋酸钾而非醋酸钠，因为十二烷基硫酸钾盐远比钠盐难溶。
(5) 在 4℃ 用 20000 g 离心碱裂解液（或 Sorvall GSA 转头，11000 r/min）30 min，无须制动，让转头自然停止。将上清轻轻移入量筒中，弃去离心管中的沉淀。
不能形成紧密的沉淀的原因常常是加入裂解液Ⅱ时混匀不充分。如果细菌碎片不能形成紧密的沉淀，以 20000 g ( Sorvall GSA 转头为 11000 r/min）再次离心 15 min，然后将上淸尽量移入干净的离心管中。转移的时候使用四层纱布过滤上清可以除去黏稠的基因组 DNA 和蛋白质沉淀残余。
3. 质粒 DNA 的回收
(1) 量取上清的体积，将其连同 0.6 倍体积的异丙醇一起移入一只洁净离心管中并将其充分混匀，室温下放置 10 min。
(2) 在室温下以 12000 g ( Sorvall GSA 转头为 8000 r/min）离心 15 min 回收核酸沉淀。
若在 4℃ 下离心会使盐也沉淀下来。
(3) 小心弃去上清，将离心管敞开盖，倒置于纸巾上以除去残余的上清。在室温下用 70% 的乙醇涮洗管底及管壁，倒掉乙醇，并用与真空管道相连的巴斯德吸管除去附于管壁的液滴。将离心管开口倒置于纸巾上使剩余的乙醇挥发掉。
如果用干燥器或真空干燥的方法干燥 DNA 沉淀，在某些情况下它会变得难以溶解并且可能变性（Svaren et al. 1987），将沉淀在室温下干燥 10~15 min 对于乙醇挥发来说足够了，而且不会引起 DNA 脱水。
(4) 用 3 ml TE ( pH 8.0 ) 溶解湿润的核酸沉淀。
(5) 粗制质粒 DNA 的纯化可用柱层析法，聚乙二醇沉淀法或 CsCl-溴化乙锭梯度离心法。
(6) 用限制酶酶切及凝胶电泳分析确证质粒的结构。
1. 缓冲液和溶液
(1) 碱裂解液Ⅰ
50 mmol/L 葡萄糖；25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
溶液Ⅰ一次可配制 100 ml，在 15 psi（1.05 kg/cm2）压力下蒸汽灭菌 15 min，保存于 4℃。
若欲用柱层析进一步纯化所制备的质粒 DNA，无菌的碱裂解液Ⅰ在使用前可补充以适当体积的去 DNA 酶的 RNA 酶 A（胰 RNA 酶）（20 mg/ml），使之终浓度为 100 μg/ml，若欲用其他的方法纯化 DNA，则不推荐在此步骤添加 RNA 酶。
(2) 碱裂解液Ⅱ
0.2 N NaOH（从 10 N 贮存液中现用现稀释）；1%（m/V）SDS。
溶液Ⅱ要现用现配，室温下使用。
(3) 碱裂解液Ⅲ
5 mol/L 乙酸钾 60.0 ml；冰乙酸 11.5 ml；H2O 28.5 ml。
所配成的溶液中钾的浓度为 3 mol/L，乙酸根的浓度为 5 mol/L。保存于 4℃，用时置于冰浴中。
(4) 用于筛选质粒的抗生素
(5) 氯霉素（34 mg/ml）
(6) 乙醇
(7) 异丙醇
(8) STE
(9) TE（pH 8.0）
2. 酶和缓冲液
(1) 溶菌酶（10 mg/ml）
(2) 限制性内切核酸酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶
4. 培养基
LB、YT 或 Terrific 培养液
5. 离心机和转头
Sorvall CSA 转头或与之相当的转头。
二、方法
1. 细胞的制备
(1) 挑取转化细菌的单菌落（或用 0.1~1.0 ml 单菌落的培养物），接种到 30 ml 含适当抗生素的培养基（LB、YT 或 Terrific 培养液）中。
为了确保培养物通气良好：试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大 4 倍；试管不宜盖得过紧；应在剧烈振摇下温育。
(2) 在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期（OD600 约为 0.6）。
(3) 在含 500 ml LB、YT 或 Terrific 培养液（预热到 37℃）及适当抗生素的烧瓶（2 L）中接种 25 ml 对数生长期晚期的菌液。将此培养液在 37℃ 剧烈振摇（300 r/min）培养约 2.5 h。
最后菌液的 OD600 值应约为 0.4。由于不用菌株的生长速度不同，可稍微延长或缩短培养时间，使最终的 OD 值为 0.4。
(4) 若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒，在培养液中添加 2.5 ml 浓度为 34 mg/ml 的氯霉素，使其终浓度为 170 μg/ml。
重要：对于高拷贝数的质粒，不必添加氯霉素。
(5) 于 37℃，以 300 r/min 剧烈振荡再培养 12~16 h。
(6) 取部分菌液（1~2 ml）到离心管中，4℃ 贮存。于 4℃，以 2700 g（对于 Sorvall GSA 转子是 4100 r/min）离心 15 min 以收集余下的近 500 ml 培养物。弃上清，倒置离心管使残余的上清流出。
(7) 用 200 ml 冰预冷的 STE 重悬细菌沉淀，按步骤 6 所述重新收集细菌并贮存于 -20℃。
(8) 用步骤 6 中贮存的 1~2 ml 菌液提取质粒（可使用方案 1 或 4 中的任一种方法），采用酶切和琼脂糖电泳分析此小量制备质粒，以确定大量培养菌液中正确的质粒已得以扩增。
设置这种对照可能看上去有点过于谨慎，然而它可以避免发生某些可能难以挽回的、浪费大量时间的错误。
2. 细胞的裂解
(1) 将步骤 7 中冻存的细菌在室温下放置 5~10 min 使其解冻后，用 18 ml (10 ml）碱裂解液Ⅰ重悬。
只有步骤 4 中使用了氯霉素的菌液才应参照括号中的体积数。
(2) 加 2 ml ( 1 ml）新配置的 10 mg/ml 溶菌酶。
(3) 加 40 ml（20 ml）新配置的碱裂解液Ⅱ。盖上离心管盖，轻轻顛倒数次，彻底混匀，室温下放置 5~10 min。
延长超螺旋 DNA 暴露于碱的时间会使其不可逆变性（Vinograd and Lebowitz 1996），所产生的环状卷曲 DNA 不能被限制酶切割，而且它在琼脂糖电泳中的迁移率为正常超螺旋 DNA 的两倍，难以被溴化乙锭染色。从细菌中用碱裂解法提质粒时可能会看到微量的这种 DNA。
(4) 加 20 ml（15 ml）冰预冷的碱裂解液Ⅲ。盖上离心管盖，轻轻地但完全地振荡混匀几次（此时应不再有分离的两个液相）。将离心管在冰上放置 10 min。
在放置过程中会出现由染色体 DNA、高分子质量 RNA、钾离子/SDS/蛋白质/细胞壁复含物一起形成的乳白色沉淀。在碱裂解液Ⅲ中最好使用醋酸钾而非醋酸钠，因为十二烷基硫酸钾盐远比钠盐难溶。
(5) 在 4℃ 用 20000 g 离心碱裂解液（或 Sorvall GSA 转头，11000 r/min）30 min，无须制动，让转头自然停止。将上清轻轻移入量筒中，弃去离心管中的沉淀。
不能形成紧密的沉淀的原因常常是加入裂解液Ⅱ时混匀不充分。如果细菌碎片不能形成紧密的沉淀，以 20000 g ( Sorvall GSA 转头为 11000 r/min）再次离心 15 min，然后将上淸尽量移入干净的离心管中。转移的时候使用四层纱布过滤上清可以除去黏稠的基因组 DNA 和蛋白质沉淀残余。
3. 质粒 DNA 的回收
(1) 量取上清的体积，将其连同 0.6 倍体积的异丙醇一起移入一只洁净离心管中并将其充分混匀，室温下放置 10 min。
(2) 在室温下以 12000 g ( Sorvall GSA 转头为 8000 r/min）离心 15 min 回收核酸沉淀。
若在 4℃ 下离心会使盐也沉淀下来。
(3) 小心弃去上清，将离心管敞开盖，倒置于纸巾上以除去残余的上清。在室温下用 70% 的乙醇涮洗管底及管壁，倒掉乙醇，并用与真空管道相连的巴斯德吸管除去附于管壁的液滴。将离心管开口倒置于纸巾上使剩余的乙醇挥发掉。
如果用干燥器或真空干燥的方法干燥 DNA 沉淀，在某些情况下它会变得难以溶解并且可能变性（Svaren et al. 1987），将沉淀在室温下干燥 10~15 min 对于乙醇挥发来说足够了，而且不会引起 DNA 脱水。
(4) 用 3 ml TE ( pH 8.0 ) 溶解湿润的核酸沉淀。
(5) 粗制质粒 DNA 的纯化可用柱层析法，聚乙二醇沉淀法或 CsCl-溴化乙锭梯度离心法。
(6) 用限制酶酶切及凝胶电泳分析确证质粒的结构。
常见问题
来源：丁香实验
