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质粒DNA的大量制备

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1855

实验试剂

 

1. STE
0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)

2. 溶液I
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
10mmol/L EDTA(pH8.0)
溶液I可成批配制,在6.895x104 Pa高压下蒸气灭菌15分钟,贮存于4℃。


3. 溶菌酶溶液

10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)


4. 溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)
1%SDS

5. 溶液Ⅲ
5mol/L乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
所配成的溶液对钾是3mol/L,对乙酸根是5mol/L。

实验步骤

 

1. 收获
   1) 用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。
   2) 将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。按步骤1)所述方法离心,以收集细菌细胞。

2. 碱裂解法

   1) 将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物重悬于10ml溶液I中。

   2) 加1ml新配制的溶菌酶溶液。当溶液的pH值低于8.0时,溶菌酶不能有效工作。
   3) 加20ml新配制的溶液Ⅱ。盖紧瓶盖,缓缓颠倒离心瓶数次,以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。
   4) 加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。封住瓶口,摇动离心瓶数次以混匀内容物,此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟,应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染色体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物。
   5) 用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧,可以5000转/分再度离心20分钟,然后尽可能将上清全部转到另一瓶中,弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分。
   6) 上清过滤至一250ml离心瓶中,加0.6体积的异丙醇,充分混匀,于室温放置10分钟。
   7) 用合适转头于室温以500转/分离心15分钟,回收核酸。如于4℃离心,盐也会了生沉淀。
   8) 小心倒掉上清,敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽,于室温用70%乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇,用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴,于室温将瓶倒置放在纸巾上,使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。
   9) 用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
  10) 纯化。

3. 质粒DNA的纯化

   1) 将所得核酸溶液转入15mlCorex中,再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液,充分混匀,用合适转头于4℃下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。
   2) 将上清转移到另一30mlCorex管内,加等量的异丙醇,充分混匀,用SorvallSS34转头(或与其相当的转尖)于室温以10 000转/分离心10分钟,回收沉淀的核酸。
   3) 小心去掉上清,敞开管口,将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70%乙醇洗涤沉淀及管壁,流尽乙醇,用与真空装置相连的巴斯德吸管吸去附于管壁的所有液滴,敞开管口并将管倒置,在纸巾上放置几分钟,以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。
   4) 用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml )的TE(pH8.0)溶解沉淀,将溶液转到一微量离心管中,于室温放置30分钟。
   5) 加500μl含13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1.6mol/L NaCl,充分混合,用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟,以回收质粒DNA。
   6) 吸出上清,用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚:氯仿、氯仿各抽1次。
   7) 将水相转到另一微量离心管中,加100μl 10mol/L乙醇铵,充分混匀,加2倍体积(约1ml)乙醇,于室温放置10分钟,于4℃以12 000g离心5分钟,以回收沉淀的质粒DNA。
   8) 吸去上清,加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。
   9) 吸去上清,敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。
   10) 用500μl TE(pH8.0)溶解沉淀1:100稀释后测量OD260,计算质粒DNA的浓度(1OD260=50μg质粒DNA/ml),然后将DNA贮于-20℃。

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