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核酸染色技术——Feulgen显示DNA法

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世界上大多数生物体的遗传物质 主要是核酸,无论生物处在生殖、生长、发育、变异等任何一个生命阶段都要受到核酸的调节。因此核酸成为人们了解生物的研究对象。核酸太小,我们无法用肉眼看到,只能通过显微和染色技术,我们才能看到它们。

一、DNA和RNA的简单结构

组成DNA分子 的脱氧核糖酸主要有四种,即dAMP、dGMP、dCMP和dTMP,它有三个级别的结构即一级、二级和三级。

一级结构是由四种脱氧核糖核苷酸 通过3,′-5′磷酸二酯键被此连接而成的线状或环状大分子,没有侧链。

二级结构是双螺旋 结构,以一共同轴为中心,以一条5′-3′,另一条为3′-5′相反向,但互相平行的脱氧核糖苷酸链组成(即所称的麻花结构).

三级结构是指双螺旋 链作进一步的扭曲构象。

组成RNA的四种碱基分别是:腺嘌呤,鸟嘌呤,胞嘧啶和胸腺嘧啶。

核酸受许多条件的制约,如温度、酸碱性试剂等。

最常导致核酸变化的是核酸的变性,当温度升高至50℃以上时,DNA的双螺旋结构即被破坏,氢键断裂,原来的两条结构链被彼此分开,涉及此种情况的是免疫组化染色方法时的前期处理,如抗原修复,微波辐射技术,水溶锅或者高压锅的抗原修复等,都涉及至双链的变化(见抗原修复法)。本文只谈核酸的形态学的显示。

二、Feulgen显示DNA法

1.切片应用硅化玻片裱片后烘烤2h。

2.切片脱蜡至水。

3.用5NHCL于20℃处理切片40分钟。

4.直接进入Schiff试剂作用60分钟左右。

5.0.5%偏重亚硫酸钠洗3次,1-2分钟/次。

6.流水冲洗5-10分钟。

7.脱水、透明,中性树胶封固。

结果:DNA呈鲜红色或紫红色。

注意事项:

1.该法也可应用1NHCL水解切片,但液体需预热至60℃。

2.临用时配制5NHCL,在加入HCL时,液体温度可升高,这样可减少切片水解的作用时间。

3.水解所用的1NHCL和5NHCL两种,根据实验证明,5NHCL比,1NHCL效果较好。

4.显示完DNA后,也可用淡绿等衬染背景,使背景呈现为绿色。

5.组织块固定可用甲醛配成的固定液如中性缓冲福尔马林液,Carnoy氏液,Helly氏液等固定,但不能用Bouin液固定,固用它固定会引起组织的过度水解。

三、核仁组成区和酸性粘多糖复合显示法(Combining method for Argyrophilic proteins of the nucleolar organizer regions and acid musin)

(1)试剂的配制:

①2%的甲酸和2%的明胶各一份,加入50%的硝酸银2份,测PH值约2-2.5。

②取0.5g阿申蓝(8GX)溶于3%的醋酸溶液中100ml,PH2.5。

(2)操作步骤:

①切片脱蜡至水,浸入蒸馏水中。

②浸入胶性银液中在暗室室温中染30-40

③蒸馏水彻底冲洗

④滴阿申蓝液于切片上于室温染色30分钟。

⑤水洗。

⑥常规脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。

结果:核仁组成区(AgNOR)显示大小不一的黑色颗粒;酸性粘多糖呈现;深浅不一的蓝绿色。

四、粘多糖和核仁组成区双染法(Double staining for cabohydrate and ANOR)

(1)试剂配制:

a)Schiff氏试剂见前。

b)胶性银液见前。

(2)操作方法:

①切片脱蜡至水;

②蒸馏水浸泡;

③0.5%高碘酸水溶液氧化切片10min;

④流水洗,蒸馏水浸洗1min;

⑤Schiff氏试剂浸染20min。(避光)

⑥1%偏重亚硫酸钠或钾水溶液浸洗3次,每次1min;

⑦自来水冲洗,蒸馏水洗1min;

⑧胶性银液浸染40min (暗室);

⑨蒸馏水充分浸洗;

⑩常规脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。

结果:粘多糖呈深浅不一的红色,AgNOR呈现大小不一的黑色颗粒,炎性及良性肿瘤,AgNOR呈较均匀一致的黑色颗粒,无分叶或较少分叶。如为恶性肿瘤,AgNOR则呈现大小不一的黑色颗粒,分叶较多,有的多达3-5个分叶。背景呈现淡黄色。

(3)注意事项:

①PAS-胶性银染色注意染色的顺序,如果先染胶性银,再染PAS,则不能顺利完成,因为当染完胶性银后,再染PAS时,由于切片需要用高碘酸氧化切片,使切片中含有1:2乙二醇基氧化而产生游离醛,但这种氧化的同时,也将已着染的氧化银颗粒给氧化掉,造成双染色的失败。

②切片在Schiff氏试剂中应根据其含量的多少来决定浸染的时间,含量多的浸染时间可以相对减少,含量少的浸染时间可以相对延长。

③胶性银液的浸染应根据室温来确定浸染时间,室温高浸染时间可相对减少,室温低应相对延长。

④慎防胶性银过染,导致着染的银颗粒分辨不清。

(4)临床和研究性应用

①用于良恶性肿瘤的鉴别诊断,良性肿瘤以及炎性组织,AgNOR的染色颗粒均匀一致,颗粒不粗,恶性肿瘤AgNOR的染色颗粒较粗,分叶较多,结构不均匀,分布杂乱。

②DNA量的增加可确定肿瘤细胞的生长跃。在HE染色中,许多肿瘤细胞核染色加深,这是由于DNA或RNA量的增加所致。

生物体内的核酸主要DNA和RNA两类。DNA主要存在于细胞核中,RNA多数存在于细胞质中,DNA通过RNA的表达来调控生物的生理时期和对外界环境的应对。核酸染色技术利于我们了解在生物的生活状态及其不同时期的核酸分布。

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