动物组织样品RNA的抽提

互联网2013-08-19

1877

动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解，以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。

一、实验材料：

Trizol试剂

研钵，匀浆器，镊子，铝箔都高温灭菌即可；

二、具体过程：

1、样品在离体后应迅速冷冻在液氮中，若是比较大块的组织，要尽量把组织剪切成黄豆大小的块，使液氮迅速渗透到组织内部而防止组织内部的RNA降解。组织用铝箔包好或放入冻存管中，并做好记号，注意不要把记号写在纸上，以防纸被组织的血水渗透而导致记号模糊。可以把铝箔放入纱布袋并储存在液氮中。

2、在抽提RNA前，先把研钵预冷，往研钵内反复加入液氮，至少4-5次，使研钵充分预冷。从液氮罐中取出样本后，把组织块放入已预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮（图1），整个过程都不要使液氮挥干。一次研磨的组织块重量不要超过300mg。

图1 用研钵在液氮中把样品研成粉末

3、研磨到组织样品成粉末状后（一般需要8-10min的研磨过程），在液氮基本挥发完时，在每个研钵中加2-3ml Trizol试剂。由于此时研钵很冷，Trizol加入后会冻结成固体状（图2）。可以继续研磨此固体成粉末（图3），随着研钵温度回升到室温，固体状的Trizol逐步回复到液体状态（图4），此时，若发现液体很粘，研杵能牵起丝状物，说明Trizol的量太少，需在此步继续补加Trizol。若Trizol的量过少，会导致抽提的RNA中有较多的基因组DNA污染。由于Trizol试剂中含有强烈的RNA酶抑制剂，因此组织样品和Trizol充分研磨混匀后就不用担心RNA的降解了。

图2 在冰冷的研钵中加入Trizol试剂后图3 继续把成固体状的Trizol进行研磨
，Trizol试剂会冻结成固体

图4 随着研钵的温度回复到室温，Trizol试剂逐步又变为液体

4、把此Trizol试剂转移到玻璃匀浆器中，再进一步匀浆3-5min（图5）。

图5 Trizol试剂转移到玻璃匀浆器中，再进一步匀浆

5、再把Trizol试剂转移到1.5ml离心管中（图6），后续可以按照Trizol试剂的标准操作抽提总RNA。

图6 把Trizol试剂转移到1.5ml的离心管中

说明：

1、研磨，匀浆过程中使用过的器具放入八四消毒液中浸泡消毒一天后，再用洗涤灵洗刷干净晾干后泡酸过夜，洗刷晾干后包上铝箔高压灭菌后，180℃烘烤4小时以备下次使用。

2、此方法看上去过程虽然比较繁琐，但得到的RNA质量好，抽提的RNA量比其他方法要高，比如米粒大的胃镜标本平均能提出约10 g总RNA，足够做一张人22K全基因组芯片了。得到的RNA的电泳检测图片如图7。 3、另外在我们的工作中，接触到一些用户在取了组织后，马上冻到-70℃冰箱来保存，然后提取RNA做反转录，这样的样品中RNA往往有较大的降解，用来做一些基因的RT-PCR还可以，但若做芯片工作就不行了。要尽量先液氮速冻。

图7 用以上方法抽提胃镜标本的RNA甲醛变性胶电泳图

(责任编辑：大汉昆仑王)