FFPE组织样品的DNA和RNA纯化

福尔马林固定后石蜡包埋的组织简称为FFPE样品。

将组织在 4–10% 的福尔马林中迅速固定。 固定时间限制在 14–24 小时 (越长的固定时间将越容易导致DNA的片段化，对下游实验不利)。将固定组织彻底脱水 (彻底脱去福尔马林残余，因为其阻碍蛋白酶K的作用)。
纯化DNA时，使用新鲜从石蜡块上切下的组织，每次制备最大量：. 每片10 μm. 最多 8 片, 每片大约 250 mm2, 如果对样品总量和产量没有把握，建议用2-3 片样品进行一次预实验。

QIAamp DNA FFPE Tissue FFPE组织样品DNA操作流程

■ 去除石蜡：融解于二甲苯并去除

■ 裂解：在变性条件下和 proteinase K 孵育

■ 加热90°C ：逆转交联

■ 结合上柱：合适的溶液环境下，DNA 结合上硅胶膜柱

■ 洗涤： 洗涤残留污染物

■ 洗脱：纯化并浓缩的DNA

试剂盒中溶液配方和含量New Elution Buffer ATE (调节到较高的pH, 与PCR 酶的通适性更强）

FFPE样品 RNA 和 miRNA 纯化原理简述：

经福尔马林固定的组织会引起RNA-RNA和RNA-蛋白交联，这些会影响RNA在下游应用中的表现。miRNeasy FFPE Kit提供特有的裂解液和孵育条件，逆转福尔马林对DNA造成的修饰。由此可确保抽提所得RNA在包括real-time RT-PCR等一系列下游应用中最优的表现。独特的裂解缓冲夜可将RNA从组织切片中有效释放出来，同时避免RNA进一步的讲解。该试剂盒也应用gDNA 去除柱有效去除基因组。经优化的结合条件可确保纯化大约18 nt以上的RNA。RNA产量和表现都优于 其他miRNA纯化方法，如苯酚-氯仿抽提法。

操作过程：

整个miRNeasy FFPE过程可在70分钟内完成。经优化的裂解缓冲夜可确保在15分钟内应用蛋白酶 K 裂解样本，不影响RNA产量。裂解之后，在80ºC条件下孵育样本15分钟，逆转福尔马林交联。然后应用gDNA去除柱快速去除基因组 DNA，应用 RNeasy MinElute spin columns纯化浓缩的RNA。由于RNA仅洗脱至14-30 µl，下游应用中的反应体积可更小 。

各种文献对于RNA纯化的经验总结：

1、获得样品后，尽快开始固定。

2、将样本切薄再浸泡 (如果能到 5mm 或更薄最好)。

3、避免过度固定，浸泡时间过长。

4、RNA 纯化要包括逆转胶联的步骤。QIAGEN的试剂盒中的步骤正满足这样的建议。

5、纯化的样品最好是固定或者包埋时间在半年内的样本。放置时间越长，对于RNA纯化越不利。

在后续逆转录反应中，使用随机引物或者混合物而不是仅仅使用oligo-dT。设计逆转录PCR时，注意扩增子的片段长度不要过长。

Figure 1. Recovery of small RNA fragments from FFPE tissues. Agilent bioanalyzer analysis was carried out on RNA purifed from
RNAlater stabilized tissues (RNAlater), FFPE tissues stored for 1 year (FFPE 1 year), or FFPE tissues stored for 1 week (FFPE 1 week).

RNA was successfully purified from both the 1-week-old and 1-year-old FFPE tissues, including partially degraded small RNA fragments (Figure 1). Significant degradation of RNA in the FFPE tissues occurred after 1 year of storage, as demonstrated by the reduced size of the RNA and disappearance of the rRNA double peaks in the Agilent bioanalyzer traces. RNA purified from all tissues yielded A260/A280 ratioundefined of around 2.0, an indication of high purity.

RNA preparation: RNA was purified from the tissue samples after 1 week or 1 year of storage. For the FFPE tissues, RNA was purified from 1–4 sections of 10 μm thickness using the RNeasy FFPE Kit.

Sections were cut on a standard microtome and the first 2 sections were discarded to exclude the effects of air exposure. For the RNAlater stabilized tissues, RNA was purified using the RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. RNA was quantitated by measuring absorbance at 260 nm on a NanoDrop® spectrophotometer. RNA quality was assessed on an Agilent® bioanalyzer in “Eukaryotic Total RNA Nano” mode.