豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的分离培养与鉴定

 

魏运军,张学渊　　(第三军医大学附属西南医院耳鼻咽喉科,重庆400038)

　　提　要: 目的　建立稳定可靠的耳蜗微血管内皮细胞分离培养方法。方法　采用显微解剖法分离出耳蜗血管纹,组织块培养法进行体外培养。结果　接种后2 d ,部分组织块边缘有散在的细胞生长,之后细胞数逐渐增多,10 d 左右以组织块为中心可见成片细胞组成的细胞集落。倒置显微镜下,单个培养细胞多呈长梭形,而融合成片状单层的培养细胞排列紧密,有内皮 细胞培养 时典型的“铺路石样”外观。经纯化后,95 %以上的培养细胞第Ⅷ因子相关抗原显示阳性反应。结论　本研究方法能够获取体外培养的耳蜗微血管内皮细胞。
　　关键词: 内皮细胞; 细胞培养 ;毛细血管;耳蜗

Isolation , culture and characterization of cochlea microvascular endothelial cells from guinea pigs
WEI Yun2jun , ZHANG Xue2yuan (Department of Otorhinolaryngology , Southwest Hospital , Third Military Medical University , Chongqing 400038 , China)
　　Abstract : Objective 　To set up a reliable method for isolating and culturing cochlea microvascular endothelial cells. Methods 　Cochlea stria was separated by micrergy from guinea pigs and the stria tissue nubbles were cultured in vitro. Re sults 　Two days later , a few cells were seen dis-seminately around partial tissue nubbles and their number was increased with time prolongation. There were some cellular colonies consisted of large quantity of cells around the partial tissue nubbles on 10 th day. Under the inversion microscope , the single cultured cells presented a long fusiform and the confluent monolayer cells linked tightly and exhibited the typical structure of“scree”of cultured endothelial cells in vitro. After purification ,over 95 %of the cultured cells showed factor Ⅷrelative antigen positive reaction. Conclusion 　The method used in this study can obtain cochlea mi-crovascalar endothelial cells of guinea pig in vitro.
　　Key words : endothelium cell ; cell , cultured ; capillaries ; cochlea

　血迷路屏障是存在于血液与内耳迷路液之间、具有选择性通透功能的生理屏障系统,其作用在于保持迷路液成分的相对稳定,维持内耳微环境的平衡,从而保证内耳感音装置行使正常生理功能,同时,血迷路屏障通透性变化很可能是某些内耳疾病发病机制的重要环节,研究血迷路屏障的通透性已成为近年来国内外耳科学研究的热点之一[1 ,2 ] 。迄今为止,由于国内外一直沿用传统的在体( in vivo) 研究的实验方法,受到活体动物研究技术条件的限制,使该项研究目前进展缓慢。内耳特定部位(如耳蜗血管纹等) 的微血管内皮细胞是构成血迷路屏障的基础,本研究旨在建立内耳微血管内皮细胞的培养方法,获取单层融合的血管内皮,并通过离体( in vitro ) 研究该血管内皮,从而实现对血迷路屏障体外模型的进一步研究。

1 　材料与方法
1. 1 　豚鼠耳蜗血管纹组织块的分离与培养
　　选取重约300 g 的封闭群豚鼠10 只,雌雄兼有,均耳廓反射灵敏,耳镜检查正常。以1 %戊巴比妥纳(40 mg/ kg) 腹腔注射麻醉,断头,迅速取出双侧听泡,用75 %酒精浸泡2 min ,无菌等渗盐水冲洗后浸入D2Hanks 液中。解剖显微镜下剪去听泡骨壁,钩破蜗尖,自顶回至基底回完整剥离出耳蜗外侧壁软组织带,并仔细分离出含深色色素的血管纹,将血管纹组织块切碎,均匀平铺于两个35 mm 的培养皿底(事先加有鼠尾胶原) , 静置30 min ,向培养皿中加入含有25 %胎牛血清(Hyclone) 的 DMEM培养液( Hyclone , 另加L2谷氨酰胺0. 9 g/ L , Hepes 20 mmol/ L ,青霉素100 U/ ml ,链霉素100μg/ ml) ,置5 % CO ₂ ,37 ℃ 培养箱中培养[3 ] 。有细胞生长后,每3 d 更换约1/ 2 的培养液, 10 d 后进行首次传代:吸掉全部培养液,用D2Hanks 液冲洗培养皿3 次,用0. 25 %胰蛋白酶(含0. 01 % EDTA ,Sigma) 消化液消化,常温下约5 min 大部分细胞开始脱壁,中止消化,取出组织块,将细胞悬液离心,弃去上清液后加培养液,台盼蓝染色并计数,细胞成活率约90 %。将未染色的细胞悬液接种于培养瓶中继续培养,细胞密度为(2～3) ×10 ⁵ / ml 。

1. 2 　培养细胞纯化
　　在细胞传代时,当加入消化液后,显微镜下只要观察到约 3/ 4 的细胞回缩近圆形时即中止消化(经需5 min) ,轻轻吹打后将细胞悬液种入空白培养瓶,而脱壁慢的1/ 4 的细胞则弃掉, 即每次传代只保留脱壁较快的约3/ 4 的培养细胞,当细胞悬液接种后,当观察到约3/ 4 的细胞贴壁后(约18 min) ,即吸掉培养瓶中的培养液,连同尚未贴壁的1/ 4 的细胞一起弃掉,重新加入培养液置CO ₂ 孵箱中培养。传代后12 h ,培养细胞已完全伸展,在倒置显微镜下刮去已贴壁的可疑杂细胞。上述操作在前三代细胞传代时连续进行[3 ,4 ] 。

1. 3 　培养细胞的免疫组化(S2P 法) 鉴定
　　将生长于盖玻片上的第四代培养细胞用4 %多聚甲醛固定,PBS 冲洗后加3 %H ₂ O ₂ -甲醇37 ℃孵育30 min ,10 %羊血清封闭,加入1∶100 的兔抗人Ⅷ因子抗体4 ℃湿盒过夜,PBS 冲洗3 次后加入1∶100 的羊抗兔IgG,充分冲洗后加入1∶100 三抗,DAB 显色,复染液复染后摄片。空白对照用PBS 代替Ⅷ因子抗
体,其余步骤不变,阴性对照则使用豚鼠肝细胞[5 ] 。