原理
在体外，内皮细胞在内皮细胞生长因子存在的条件下可迅速增殖，并可传代，可作为内皮细胞增殖，细胞因子分泌、表型等研究的模型。
材料与仪器
胶原酶 血清
Cord Buffor 硫酸链霉素 生埋盐水 EDTA-Na 明胶
插管 止血钳 注射器 手套 丝线 饭盒 匀浆机 离心机 振荡器 培养瓶 CO孵箱 显微镜 超净工作台 孔板
Cord Buffor 硫酸链霉素 生埋盐水 EDTA-Na 明胶
插管 止血钳 注射器 手套 丝线 饭盒 匀浆机 离心机 振荡器 培养瓶 CO孵箱 显微镜 超净工作台 孔板
步骤
一、脐带内皮细胞的分离
1. 脐带收集
用无菌止血钳夹闭脐带两端，在止血钳外侧剪断脐带，放入盛有4 ℃Cord Buffer的饭盒内。脐带在4 ℃放置不应超过24 小时。
2. 脐带内皮细胞分离
（1）带无菌手套，取出脐带，在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后，用无菌剪刀将两端脐带剪除。
二、牛下丘脑内皮细胞生长因子粗提物的制备
1. 取新鲜牛下丘脑，加1.5倍体积的冰生理盐水用组织匀浆机匀浆，每次0.5 min，共6次。
7. 过滤，分装，-20 ℃保存备用。
三、内皮细胞的培养与鉴定
2. 原代培养
将从脐带静脉中收集到的内皮细胞移入包被明胶的培养瓶（25 cm），加5～7 ml 20 ％小牛血清199培养基，按终浓度分别为20 μg/ml和100 μg/ml加入内皮细胞生长因子粗提物和肝素。每3～4 天换液1 次。
3. 传代培养
待内皮细胞生长铺满瓶底后即可传代。吸去培养基，用无血清RPMI1640 2 ml洗培养瓶1 次。加入0.1 ％胰酶、0.02 ％EDTA-Na 3 ml，放37 ℃孵箱。待镜下见大多数细胞卷缩变圆，可加入含血清培养基3 ml，以终止胰酶的消化作用，用弯头滴管吹打。收取细胞悬液，加入离心管中，离心1500 rpm，10 min。弃上清，以完全培养基重悬细胞，移入培养瓶扩大培养。
4. 内皮细胞鉴定
光镜下内皮细胞为多角形或梭形，可见1～2 个清晰的细胞核。透射电镜下， 部分内皮细胞中可有特征性的Weible-Palade小体存在。间接免疫荧光染色，内皮细胞为ⅧR∶Ag阳性。
四、牛下丘脑内皮细胞生长因子粗提物活性的测定
1. 0.1 ％胰酶0.02 ％EDTA消化收获内皮细胞，计数，调整细胞数至5×104 /ml。
1. 脐带收集
用无菌止血钳夹闭脐带两端，在止血钳外侧剪断脐带，放入盛有4 ℃Cord Buffer的饭盒内。脐带在4 ℃放置不应超过24 小时。
2. 脐带内皮细胞分离
（1）带无菌手套，取出脐带，在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后，用无菌剪刀将两端脐带剪除。
（2）在脐带一端找到静脉，插入脐带静脉插管，用2 根粗丝线扎牢，用Cord Buffer抽吸有的30 ml注射器冲洗静脉腔，至将脐血洗净。
（3）赶出静脉腔内残余液体，将脐带另一端用止血钳夹闭，用10 ml注射器连接针头，注入37 ℃预热的0.1 ％胶原酶约6-8 ml，放入37 ℃ Cord Buffer中保温6-10 min。
（4）吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液，加入预加有20 ml Cord Buffer的离心管中，冲洗静脉腔，一并加入离心管中。
（5）离心，1500 rpm，10 min弃上清，用5～7 ml 20 ％FCS，RPMT 1640重悬细胞，转入培养瓶，放5 ％CO孵箱。
二、牛下丘脑内皮细胞生长因子粗提物的制备
1. 取新鲜牛下丘脑，加1.5倍体积的冰生理盐水用组织匀浆机匀浆，每次0.5 min，共6次。
2. 在4 ℃条件下用震荡器机械震荡约1.5 h。
3. 离心，10000 g，40 min，收取上清液。
4. 按0.5 ％加硫酸链霉素，4 ℃过夜。
5. 离心，20000 g，40 min，收取上清液。
6. 用紫外分光光度测280 nm，260 nm OD值按公式计算蛋白含量。
7. 过滤，分装，-20 ℃保存备用。
三、内皮细胞的培养与鉴定
1. 培养瓶包被明胶
培养瓶（25 cm）中加入0.2 ％明胶3 ml，使其铺满瓶底，放4 ℃备用。用前弃去明胶溶液。
培养瓶（25 cm）中加入0.2 ％明胶3 ml，使其铺满瓶底，放4 ℃备用。用前弃去明胶溶液。
2. 原代培养
将从脐带静脉中收集到的内皮细胞移入包被明胶的培养瓶（25 cm），加5～7 ml 20 ％小牛血清199培养基，按终浓度分别为20 μg/ml和100 μg/ml加入内皮细胞生长因子粗提物和肝素。每3～4 天换液1 次。
3. 传代培养
待内皮细胞生长铺满瓶底后即可传代。吸去培养基，用无血清RPMI1640 2 ml洗培养瓶1 次。加入0.1 ％胰酶、0.02 ％EDTA-Na 3 ml，放37 ℃孵箱。待镜下见大多数细胞卷缩变圆，可加入含血清培养基3 ml，以终止胰酶的消化作用，用弯头滴管吹打。收取细胞悬液，加入离心管中，离心1500 rpm，10 min。弃上清，以完全培养基重悬细胞，移入培养瓶扩大培养。
4. 内皮细胞鉴定
光镜下内皮细胞为多角形或梭形，可见1～2 个清晰的细胞核。透射电镜下， 部分内皮细胞中可有特征性的Weible-Palade小体存在。间接免疫荧光染色，内皮细胞为ⅧR∶Ag阳性。
四、牛下丘脑内皮细胞生长因子粗提物活性的测定
1. 0.1 ％胰酶0.02 ％EDTA消化收获内皮细胞，计数，调整细胞数至5×104 /ml。
2. 细胞悬液加入包被明胶的96孔板，每孔100 μl，5×103个细胞。
6. 放5 ％CO孵箱，继续培养12 h。
3. 放置于5 ％CO孵箱，24 h，待细胞全部贴壁生长。
4. 每孔加待检样品100 μl，每个稀释度设3个复孔，并设培养基阴性对照。
5. 放5 ％CO孵育，48～72 h，待阴性对照与阳性有明显差别时，加3HTdR，每孔0.5 μci/50 μl。
6. 放5 ％CO孵箱，继续培养12 h。
7. 细胞收集仪收集细胞，检测Cpm值可计算刺激指数。
注意事项
1. 严格无菌操作，防止在分离、培养和传代内皮细胞过程中发生污染。
2. 胶原酶消化时所需浓度，时向要进行预试。如胶原酶浓度过高，内皮细胞容易死亡；浓度过低，则细胞收获量低。
3. 内皮细胞应进行鉴定，以防将成纤维细胞误认为内皮细胞。
2. 胶原酶消化时所需浓度，时向要进行预试。如胶原酶浓度过高，内皮细胞容易死亡；浓度过低，则细胞收获量低。
3. 内皮细胞应进行鉴定，以防将成纤维细胞误认为内皮细胞。
来源：丁香实验
