人脐带静脉内皮细胞的分离培养与增殖试验

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　　血管内皮细胞不仅参与调节血管通透性和凝血过程，在免疫调节，移植排斥，肿瘤转移，炎症等许多过程中也具有重要作用。内皮细胞培养 是体外研究内皮细胞功能的重要手段。70年代Eric等建立了内皮细胞分离及体外培养的方法。人脐带静脉是人血管内皮细胞最易获取的来源，在人内皮细胞的研究中被普遍采用。
　　㈠ 原理在体外，内皮细胞在内皮细胞生长因子存在的条件下可迅速增殖，并可传代，可作为内皮细胞增殖，细胞因子 分泌、表型等研究的模型。
　　㈡ 方法
　　1. 脐带内皮细胞的分离
　　试剂与器材
　　⑴ 胶原酶(Sigma)：I型((C-0130),用无血清RPMI 1640配成0.1％(W/V),分装、-20℃保存。
⑵ Cord Buffor：
NaCl0.14M 8.182克
KCl 0.004M0.298克
glucose 0.01M 2.180克
NaHPO４.12H2O0.030克
　　　　　　　 0.001M
Na2HPO４·12H2O 0.290克
　　　　　　　　　　　　　　────────
　　　　　　　　　　　　　　加三蒸水至1000ml

配好后8磅、20min高压灭菌
　　⑶ 脐带静脉插管：取16号针头去掉尾部及头部斜面，用砂纸磨平，全部套入输液用硅胶管，硅胶管另一端再接另一个16号针头。
　　⑷ 止血钳4把、30ml、10ml注射器，无菌手套、粗丝线、饭盒等。
　　操作步骤：
　　⑴脐带收集：用无菌止血钳夹闭脐带两端，在止血钳外侧剪断脐带，放入盛有4℃Cord Buffer的饭盒内。脐带在4℃放置不应超过24小时。
⑵ 脐带内皮细胞分离
　　带无菌手套，取出脐带，在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后，
　　　　　　　　　　　　　用无菌剪刀将两端脐带剪除。
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在脐带一端找到静脉，插入脐带静脉插管，用2根粗丝线扎牢，
　　　　　　 用Cord Buffer抽吸有的30ml注射器冲洗静脉腔，至将脐血洗净。
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　　 赶出静脉腔内残余液体，将脐带另一端用止血钳夹闭，用10ml注射器
　　　　　　　　　连接针头，注入37℃预热的0.1％胶原酶约6-8ml，放入37℃
　　　　　　　　　　　　　　　　Cord Buffer中保温6-10min
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　　　　　　　　　吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液，加入预加有20mlcord
Buffer的离心管中，冲洗静脉腔，一并加入离心管中。
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离心，1500rpm,10min
弃上清，用5～7ml 20％FCS，RPMT 1640重悬细胞，转入培养瓶，
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　放5％CO孵箱