人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养

 

人脐静脉内皮细胞（ HUVEC ）培养

1 ).  将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。

（注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）

2 ).  用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。

3 ).  用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml 的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。

4 ).  消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 ml无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。

5 ). 将收集液离心（2000转/分）3分钟。

6 ). 倒去上清，加入10ml M199培养基（加入10U/ml的bFGF），用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。

（ 注：每个培养瓶中加入3-4ml无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37℃孵育，最少2小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。）

7 ).  培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入10 ml新鲜的 M199培养基。

8 ).  以后每2天换一次培养基（每次换掉2/3的培养基）。

9 ). 一般培养5-7天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。

10 ). 倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2-3ml消化液（0.25%胰酶+0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。

11 ). 用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50 ml无菌离心管中，2000转/分，离心3分钟。

12 ). 倒掉上清,加入10ml新鲜培基,一般一瓶细胞可传代3-4瓶.以后照此传代培养.

        一般传代2-3代（培养了20天左右）用于做各种实验效果最好。