人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）体外管形成测定

在肿瘤发生发展过程中，肿瘤组织常处于缺氧、低营养状态，在这种条件下，由于癌细胞分泌的血管生成因子的激活，会促进大量的新血管生成，为肿瘤生长提供所需的氧气和营养物质。

由于肿瘤细胞自身可分泌多种生长因子诱导血管生成，因此无论原发性肿瘤还是继发性肿瘤伴随着都会有血管生成，血管生成是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，血管内皮细胞（HUVEC）在基质胶（Matrigel）上保留了内皮细胞增殖分裂快、迁移速度快的特点，因此 内皮细胞体外血管形成实验能够很好的模拟肿瘤血管发生过程。

在肿瘤进展的研究中，异常的血管形成被认为是促进肿瘤发展的关键因素。可用于研究某些基因或药物对这一过程的影响，血管生成调节机制的揭示，开发血管抑制药物，筛选天然抗血管生成化合物等。

人脐静脉内皮细胞、内皮细胞基础培养基、氢化可的松、胎牛血清，培养箱

含有目的基因的质粒、96 孔板、移液管、基质胶、离心机、显微镜等

一、细胞培养

1. 在内皮细胞生长培养基中培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）：内皮细胞基础培养基中添加 1 μg/mL 氢化可的松和 1 ng/mL 表皮生长因子，10% 胎牛血清，青霉素/链霉素，在 37 ℃，5% CO₂ 的条件下培养。

2. 当融合 80% 时，每次传代以 1:3 的比例分裂细胞。使用传代 2~5 次的细胞，这些细胞对生长因子的反应没有明显差异。传代 6 次之后，细胞开始衰老，不再在凝胶化的基底基质上形成管状细胞。

二、转染

1. 当 HUVECs 融合度达到 70% 时，用所需基因转染。

2. 对于 100 mm 板，使用 1 µg 空 pCDNA3 载体作为对照，1 µg 含有感兴趣基因的 pCDNA3 载体为实验组。

3. 将 1 µg DNA 与 3 µL lipofectamine 2000 配合，用稀释过的血清培养基稀释至最终体积为 200 µL，然后换新鲜培养基，并将转染液加入细胞中。在 37 °C, 5% CO₂ 的培养箱中培养细胞。

4. 转染 3 小时后加入 7 mL 完全新鲜培养基，然后在 37 °C 下进一步培养细胞 24 ~48 小时。转染后的第二天，换为新鲜的完整培养基。

三、管形成实验

1. 在准备凝胶基底之前，将 96 孔板和移液管尖端在 4 °C下冷却 1 小时。

2. 在准备基底时，将平板置于 0 ℃ 的冰块上，每孔加入 50 μL 的冷基质。

3. 将平板放在 37 °C，5% CO₂ 的培养箱中 30 分钟，让基底聚合。

4. 同时，采集细胞。用 1 mL 0.25% 胰蛋白酶 / 0.53 mM EDTA 溶液清洗 HUVECs；然后加入 2 mL 胰蛋白酶 EDTA 溶液，37 ℃ 孵育 5 分钟。倒置显微镜下观察细胞层完全分散。然后，收集细胞悬浮的培养基，在 264 xg 下离心 3 分钟，收获分离的细胞。在无血清培养液中重悬细胞。

5. 计数细胞时，将 0.2 mL 细胞悬液加入 0.5 mL PBS 和 0.3 mL 0.4% 台盼蓝溶液中。在室温下 5 分钟后，在 Bürker 室中计数细胞。

6. 将细胞重悬于浓度为 2×10⁴ 细胞 / 50 μL 的完全培养基中。将它们以每孔 2×10⁴ 个细胞的浓度接种到凝胶基底上。

7. 在 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中培养细胞 24 小时后拍摄管的形成。

8. 为了量化管形成分析的结果，可以计算至少有三个管连接的分支点的数量。使用图像软件（例如 imageJ），为每张显微照片中的每个领域计算分支点的数量，并计算每个实验条件的平均值 ± 标准误差（SE）。

1. 接种细胞置凝胶基底时，要注意单元格的数量，过多或过少的细胞都不能在凝胶基底上以正确的方式形成管状结构。观察管的形成时：HUVECs 能够在 6 小时内形成管状结构，但在 12~18 小时后可能会观察到更好的结果。

2. 在进行管形成测定之前，最好去除血清双抗使 HUVEC 细胞饥饿 3~6 小时。

3. 凝胶铺展均匀分布在整个孔上，注意要避免气泡形成。

在进行第三部分第 2 步时，容易产生气泡。同时要注意含有基质的小瓶在实验过程中应放在冰上，因为基质在室温下会变成固体。

参考文献：

[1] Hall H,  Djonov V,  Ehrbar M , et al. Heterophilic interactions between cell adhesion molecule L1 and alphavbeta3-integrin induce HUVEC process extension in vitro and angiogenesis in vivo.[J]. Angiogenesis, 2004, 7（3）：213-223.

[2] Ma H, Jiang S,Du L,et al. Conditioned medium from primary cytotrophoblasts, primary placenta-derived mesenchymal stem cells, or sub-cultured placental tissue promoted HUVEC angiogenesis in vitro[J]. Stem cell research & therapy,2021, 12（1）：141.