HUVEC分离培养

溶液以及器材：

1、用RPMI-1640配I型胶原酶 0.1g/100ml

2、配三抗：

青霉素：100ku/L

链霉素：100ku/L

庆大霉素：100ku/L

3、培养液（M199＋ECGS[3ug/ml]＋15％胎牛血清）有EGF可以适当加点10ng/ml

4、大瓶生理盐水

5、广口瓶（脐带数＋1）

6、止血钳（脐带数×2＋2）

7、大针头数个（用于吸取生理盐水，胶原酶）

8、手术剪刀数把

使用前器械高温蒸气灭菌。

实验步骤：

1、去妇产科取当天新鲜脐带（广口瓶；生理盐水），试验前放入4度冰箱。

2、辨别脐带静脉（粗大的那根），顺着静脉瓣插入大针头，注入生理盐水，充分冲洗脐静脉，至流出液体中无可见血液。

3、夹住脐带下端，从上端灌注0.1%的胶原酶，钳住脐静脉上端，37度孵育15分钟（已经足够）；如果消化液中出现絮状物，说明消化时间过长。

4、收集消化液，并用含小牛血清的RPMI-1640 冲洗脐静脉，冲洗液并入消化液中。1000－1500转离心10分钟。

5、将细胞悬浮于培养液中（一根脐带一般可以一个培养瓶，如果细胞少就六孔板一个孔），细胞不能太稀疏，否则生长缓慢。

6、正常情况下三天长满传代，正常的内皮细胞长满后如同卵石状。

7、使用前运用标记因子CD31或VIII因子对内皮细胞进行鉴定。