培养细胞的冻存及复苏

细胞低温冻存是培养室常规工作和通用技术。细胞冻存在-196℃液氮中，储存时间几乎是无限的。细胞冻存及复苏的原则是慢冻快融。
1． 冻存细胞
（1）选对数增生期细胞(证明无支原体污染)，在冻存前1d换液。
（2）按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数，使细胞密度达5×10 ⁷ ／ml左右密度，离心，去上清。
（3）加入配制好的冻存液（培养液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂10％二甲基亚砜(DMSO) 或甘油，可使冰点降低，使细胞内水分在冻结前透出细胞外。
（4）分装于无菌冻存管中，每管加1.5m悬液。
（5）旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标记。
（6）冻存：在特殊的 仪器 或简易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min时间内，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。
操作时应戴防护眼镜和手套，以免液氮冻伤。
2. 复苏细胞
（1）从罐中取出冻存管。
（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s内完成。
（3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入 离心管 中，再滴加10ml培养液。
（4）低速离心(500～1000r／min) 5min，去上清后再用培养液洗一次。
（5）用培养液适当稀释后，装入 培养瓶 37℃培养，次日更换一次培养液后，继续培养。以后仍按常规进行培养。
冻存细胞数量要充分，密度应达到10 ⁷ ／ml，在融后稀释20倍时，仍能保持5×10 ⁵ ／ml数量。