世纪之交的基因治疗载体研究
互联网
基因治疗通常是指把遗传物质（DNA或RNA）引入到患者的细胞中，以达到治疗疾病的目的。它是伴随着基因工程技术和分子生物学的发展而逐渐形成的一种新型“分子治疗”手段。1990年9月，美国科学家Anderson博士等人进行了首例基因治疗的临床试验。到目前为止），全世界范围内已经批准进行了400多个临床试验方案。1991年，复旦大学的薛京伦教授研究小组进行了我国第一例基因治疗临床试验，说明我国在此研究领域起步较早。人类基因组的DNA序列工作框架图的完成，标志着功能基因组时代的到来，人类对自身基因的功能特别是与疾病相关的基因的了解将大大加快。这对基因治疗的研究无疑会产生巨大的推动作用。虽然目前基因治疗在有效性、可操作性和安全性等方面面临着不少问题，但我们有理由相信在不远的将来必会产生突破性的进展，并带来具有深远意义的医疗革命。在基因治疗的研究中，基因导入系统是最关键的技术。本文试对基因治疗载体应用的原理、种类和研究现状分几方面做简要介绍。
二 病毒性载体
外源基因进入细胞中通常需要“运输工具”。病毒是在漫长的自然进化过程中存活下来的没有细胞结构的最小、最简单的生命寄生形式。它们通常可以高效率地进入特定的细胞类型，表达自身蛋白并产生新的病毒粒子。因此，病毒是首先被改造作为基因治疗的载体。原则上讲，所有的病毒通过一系列的处理如删除与致癌、致毒和复制相关的基因等片段，在合适的位置插入外源治疗基因，均可发展成为基因传递的工具。但由于对不同病毒的生活周期、分子病理学等方面的了解相差很大，现在主要采用四种病毒载体类型：
1）反转录病毒载体（包括慢病毒载体）
2）腺病毒载体
3）腺相关病毒载体
4）单纯疱疹病毒载体。
1 反转录病毒载体：反转录病毒属于正链RNA病毒，可高效地感染许多类型的宿主细胞，并稳定地整合到宿主细胞基因组中。它是最先被改造且应用最为广泛（>50%）的基因治疗载体。反转录病毒基因组大约10kb，含有三个最重要的基因：gag（编码核心蛋白）、pol（编码反转录酶）和env（编码病毒外膜蛋白）。基因排列顺序是5’—gag—pol—env—3’。两端存在长末端重复区（LTRS）用于介导病毒的整合。env基因中含有病毒包装所必需的序列。另外，一些反转录病毒中存在原癌基因，其突变会引起癌变的发生，当其整合到宿主细胞中原癌基因的附近或插入到宿主细胞的抑癌基因中，也可能致使细胞癌变。构建反转录病毒载体多来源于鼠白血病病毒（Mo-MLV），此类病毒为嗜双性病毒，既可感染鼠细胞亦可感染人细胞。反转录病毒载体的基本成份包括
（1）必需的病毒基因组分如LTRS、病毒的包装识别信号、翻译所需的剪接识别位点及poly（A）尾等。
（2）高效的治疗基因如抑癌基因、自杀基因等。
（3）标记基因，用于筛选。
（4）其它质粒必要成分。在应用上，携带外源目的基因的反转录病毒载体需要包装细胞如ProPak（最常用）、PA317等细胞系才能成为成熟的重组“假病毒粒子”。因为构建的复制缺陷型反转录病毒载体，外源目的基因取代病毒的必需基因，使得其必须借助包装细胞提供病毒复制所需的反式作用蛋白，才能包装产生子代重组病毒。这种子代重组病毒也仅仅具备一次感染性，从而避免了在人体细胞间扩散感染，也大为降低了病毒本身的致癌性与致病性。作为基因治疗载体，反转录病毒载体具有感染率高，可稳定整合表达、宿主范围广泛、对宿主毒性小等优点，但同时也存在仅感染正在分裂的细胞、整合可能致癌、包装外源DNA小（＜8kb）等缺陷。目前在基础与临床研究中多适用于间接体内（ex vivo）基因治疗，特别是肿瘤的基因治疗。去年法国巴斯德研究所的Cavazzana-Calvo等人成功地采用反转录载体在两个患有X-染色体关联的严重联合免疫缺陷症的婴儿身上实施了基因治疗方案。此疾病是由于编码某种细胞因子受体组份的γc亚基缺陷而引起了T细胞、NK细胞等淋巴细胞的发育不良。此研究小组利用鼠白血病病毒来源的反转录病毒载体构建了γc亚基cDNA基因的重组病毒载体。再从患者体内分离到CD34分子阳性的造血干细胞，采用间接体内治疗的方法，把转染外源基因的干细胞回输到病人血液中。治疗的效果十分显著！十个月后，两人免疫系统的T、B与NK淋巴细胞均变为正常，三个月后便解除了在医院所需的“保护性隔离”，而在家中调理。此方案第一次清晰地说明了基因疗法可以治疗遗传病，它对基因治疗的理性发展有很好的推动作用。
