关于基因治疗载体的选择的一点看法
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1.1 腺病毒载体
腺病毒是较早用来转基因的一种载体，它对人体无致病性， 生物 安全性好；它的宿主范围广，而且可以感染静止细胞（如造血干细胞）。但早期以腺病毒为载体转导造血干细胞的转基因效率很低。腺病毒在进入宿主细胞后，其病毒DNA并不整合到宿主基因组上，是造成转基因效率低的原因之一。有研究发现在造血干细胞表面缺乏腺病毒的特异性受体，所以一度认为造血干细胞不是腺病毒的合适的靶细胞。个别报道通过提高腺病毒的滴度可在造血干细胞获得较高的转基因效率[2]，但是病毒滴度过高又会破坏造血干细胞，使转导效率降低，所以单纯提高病毒滴度并不是一个可行的方案。Karen等[3]通过在体外的腺病毒与造血干细胞的混合培养物中加入多种细胞因子，保护造血干细胞集落，提高了转导效率。对腺病毒的深入研究证实该病毒主要通过病毒衣壳纤维蛋白与宿主细胞表面的柯萨奇/腺病毒受体（CAR）的结合进入细胞。在CD34+细胞中只10%15%的细胞表面有CAR表达，更早期的造血干细胞CAR表达更少。针对这一问题，Shayakhmetov等[4]以腺病毒为基础制成一种嵌合体载体，这一新型载体衣壳表达的短轴Ad35纤维蛋白可以结合到造血干细胞表面的另一种表达较多的受体上，从而提高了转导率。另有报道腺病毒与多聚阳离子的复合物也可高效转导造血干细胞。由此可见，对腺病毒载体的改造和转导介质的适当添加可以提高转导率，从而为腺病毒载体在造血干细胞转基因的应用开辟新的前景。
1.2 腺相关病毒
腺相关病毒是在对腺病毒进行研究时发现的一种非致病性的细小病毒，其宿主范围与腺病毒类似，也可以感染非分裂期的细胞。腺相关病毒作为转基因载体的突出优点是它的DNA能够整合到宿主的基因组中，所以转入的外源基因相对稳定。虽然腺相关病毒对造血细胞的识别率较高，但对腺相关病毒成功转基因入造血干细胞的报道并不多。许多研究者发现重组腺相关病毒不能有效转导造血干细胞，通常需要高复合感染，并用多种细胞因子刺激才能获得长时效性。但是也有少数学者检测到腺相关病毒高效转入造血干细胞。Chatterjee等[5]就通过FISH观察到腺相关病毒稳定地整合在造血干细胞染色体组上，并长期存在。Nathwani等[6]认为在重组腺相关病毒的复杂制备过程中混入的野生型病毒和质粒可能影响了重组腺相关病毒的转导。因此他们采用特殊的包装质粒制备出高度纯化的重组腺相关病毒，部分提高了转导效率，但转入的基因仍不能长期存在。也有提出采用柱层析等方法提纯重组腺相关病毒。近来有学者观察到重组腺相关病毒可在宿主细胞核内以非整合形式存在，并推测这可能是造成对腺相关病毒载体转导效率报道不一的原因[7]。所以腺相关病毒是否适于作为造血干细胞转基因的载体，还需要进一步的研究。
1.3 逆转录病毒载体
目前认为转基因效果确切，应用也最为广泛的一种转基因载体是逆转录病毒载体，人们对它的研究也最为深入。逆转录病毒进入宿主细胞后，其基因组RNA逆转录为DNA后插入宿主基因组，因此转入的外源基因可以稳定存在。但是逆转录病毒只能转导分裂期的细胞，这对于转导造血干细胞的是一大障碍。为了提高造血干细胞的转基因效率，人们模仿体内造血环境，在体外培养物中加入干细胞因子、白介素等细胞因子刺激造血干细胞进入分裂期，从而促进逆转录病毒转导[8]。另外，通过在培养基中加入基质细胞，纤维连接素，Flt-3配体等也可以增加造血干细胞与病毒的接触机会，在一定程度上提高转导率[9]。在比较了不同添加物增加转导的能力之后，Williams[10]提出基质细胞和纤维连接素的作用可相互替代，不必重复加入，进一步简化了转导体系。另一些工作者则希望通过对病毒自身的改造来提高转导效率。Karneko等[11]将逆转录病毒的GCsap接上不同的病毒长末端重复序列（LTR）制成新的载体转导造血干细胞后移植到免疫缺陷的NOD/SCID小鼠模型观察转基因效率，发现连接鼠干细胞病毒的LRT的载体效率明显高于其他组。有的研究者分别用吉本猿白血病病毒(GoLMV)外壳和泡状口炎病毒（VAV-G）衣壳包装双嗜性病毒，但结果各家报道不一。针对体外转导阳性细胞少的特点Matsuda等[12]在插入的外源基因中接入编码细胞集落刺激因子和鼠雌激素的嵌合序列作为选择性扩增基因。然后在培养物中加雌激素刺激，可以获得高产量的阳性转导细胞。有研究者通过在外源基因中导入绿色荧光蛋白（GFP），利用它的荧光特性筛选阳性转导细胞，然后将筛选得到的带有外源基因的造血干细胞进行移植，也间接提高了转基因效率[13]。
1.4 慢病毒载体
虽然逆转录病毒应用很广，在长期研究过程中其转录效率也得到了提高，但是一直以来逆转录病毒对于大动物和非人灵长类的转基因率都很低，且未能有效克服。为此，近年来人们又将目光转向一种对人类和大动物有较强感染力的病毒载体－慢病毒载体。慢病毒是逆转录病毒中的一种特殊类型，以HIV-1型为代表。慢病毒可以感染静止期的细胞，因此从理论上推测慢病毒应当具有高于逆转录病毒的静止期细胞转基因效率，大部分的研究结果也与这一推论一致。Uchida等[14]用假型的HIV载体转导新鲜分离的人造血干细胞获得高效率，并且高于同一条件下以鼠白血病病毒为载体的转导效率。Miyoshi[15]将慢病毒载体转导的造血干细胞植入NOD/SCID小鼠获得了长期的表达。但也有研究者发现在不用任何细胞因子刺激的情况下，慢病毒并不显示高于一般逆转录病毒的转导效率。对造血干细胞细胞周期的分析发现用目前方法分离得到的造血干细胞多数是处于G0期，而通常的静止期细胞则多数处于G1/S期。由此有人提出应用慢病毒载体转导造血干细胞时也要进行预刺激。
由于HIV的众所周知的致病性，要将其真正用于基因治疗必须经过改造。Douglas等[16]用VSV-G包被人免疫缺陷病毒，并在转入基因上接入启动子等元件，不仅增加了 生物 安全性，而且提高了表达，在转入SCID小鼠后获得了外源基因的高表达。为了提高慢病毒载体的生物安全性，Woods等[17]进行了大量的工作，他们把HIV病毒的3’端LTR去除了400个bp的 核苷酸 ，制成一种可以自身灭活的慢病毒载体，并建立了一系列的包装细胞系来提高其转导效率，而降低致病性，制成了新一代的慢病毒载体用于造血干细胞的转基因。他们研制的慢病毒载体可以有效地转基因到小鼠的造血干细胞，将转导后的造血干细胞植入到NOD/SCID小鼠，并且从这些小鼠的骨髓分离出造血干细胞再植入第二代小鼠后仍有外源基因表达。有的研究避开对人致病的HIV,采用非灵长类动物的免疫缺陷病毒作为转基因载体转导未经刺激的造血干细胞也取得了初步的成果。各方面研究证实HIV病毒是一种有效的转基因载体，如果进一步加以改进，必将成为造血干细胞介导转基因治疗的理想载体。
腺病毒是较早用来转基因的一种载体，它对人体无致病性， 生物 安全性好；它的宿主范围广，而且可以感染静止细胞（如造血干细胞）。但早期以腺病毒为载体转导造血干细胞的转基因效率很低。腺病毒在进入宿主细胞后，其病毒DNA并不整合到宿主基因组上，是造成转基因效率低的原因之一。有研究发现在造血干细胞表面缺乏腺病毒的特异性受体，所以一度认为造血干细胞不是腺病毒的合适的靶细胞。个别报道通过提高腺病毒的滴度可在造血干细胞获得较高的转基因效率[2]，但是病毒滴度过高又会破坏造血干细胞，使转导效率降低，所以单纯提高病毒滴度并不是一个可行的方案。Karen等[3]通过在体外的腺病毒与造血干细胞的混合培养物中加入多种细胞因子，保护造血干细胞集落，提高了转导效率。对腺病毒的深入研究证实该病毒主要通过病毒衣壳纤维蛋白与宿主细胞表面的柯萨奇/腺病毒受体（CAR）的结合进入细胞。在CD34+细胞中只10%15%的细胞表面有CAR表达，更早期的造血干细胞CAR表达更少。针对这一问题，Shayakhmetov等[4]以腺病毒为基础制成一种嵌合体载体，这一新型载体衣壳表达的短轴Ad35纤维蛋白可以结合到造血干细胞表面的另一种表达较多的受体上，从而提高了转导率。另有报道腺病毒与多聚阳离子的复合物也可高效转导造血干细胞。由此可见，对腺病毒载体的改造和转导介质的适当添加可以提高转导率，从而为腺病毒载体在造血干细胞转基因的应用开辟新的前景。
1.2 腺相关病毒
腺相关病毒是在对腺病毒进行研究时发现的一种非致病性的细小病毒，其宿主范围与腺病毒类似，也可以感染非分裂期的细胞。腺相关病毒作为转基因载体的突出优点是它的DNA能够整合到宿主的基因组中，所以转入的外源基因相对稳定。虽然腺相关病毒对造血细胞的识别率较高，但对腺相关病毒成功转基因入造血干细胞的报道并不多。许多研究者发现重组腺相关病毒不能有效转导造血干细胞，通常需要高复合感染，并用多种细胞因子刺激才能获得长时效性。但是也有少数学者检测到腺相关病毒高效转入造血干细胞。Chatterjee等[5]就通过FISH观察到腺相关病毒稳定地整合在造血干细胞染色体组上，并长期存在。Nathwani等[6]认为在重组腺相关病毒的复杂制备过程中混入的野生型病毒和质粒可能影响了重组腺相关病毒的转导。因此他们采用特殊的包装质粒制备出高度纯化的重组腺相关病毒，部分提高了转导效率，但转入的基因仍不能长期存在。也有提出采用柱层析等方法提纯重组腺相关病毒。近来有学者观察到重组腺相关病毒可在宿主细胞核内以非整合形式存在，并推测这可能是造成对腺相关病毒载体转导效率报道不一的原因[7]。所以腺相关病毒是否适于作为造血干细胞转基因的载体，还需要进一步的研究。
1.3 逆转录病毒载体
目前认为转基因效果确切，应用也最为广泛的一种转基因载体是逆转录病毒载体，人们对它的研究也最为深入。逆转录病毒进入宿主细胞后，其基因组RNA逆转录为DNA后插入宿主基因组，因此转入的外源基因可以稳定存在。但是逆转录病毒只能转导分裂期的细胞，这对于转导造血干细胞的是一大障碍。为了提高造血干细胞的转基因效率，人们模仿体内造血环境，在体外培养物中加入干细胞因子、白介素等细胞因子刺激造血干细胞进入分裂期，从而促进逆转录病毒转导[8]。另外，通过在培养基中加入基质细胞，纤维连接素，Flt-3配体等也可以增加造血干细胞与病毒的接触机会，在一定程度上提高转导率[9]。在比较了不同添加物增加转导的能力之后，Williams[10]提出基质细胞和纤维连接素的作用可相互替代，不必重复加入，进一步简化了转导体系。另一些工作者则希望通过对病毒自身的改造来提高转导效率。Karneko等[11]将逆转录病毒的GCsap接上不同的病毒长末端重复序列（LTR）制成新的载体转导造血干细胞后移植到免疫缺陷的NOD/SCID小鼠模型观察转基因效率，发现连接鼠干细胞病毒的LRT的载体效率明显高于其他组。有的研究者分别用吉本猿白血病病毒(GoLMV)外壳和泡状口炎病毒（VAV-G）衣壳包装双嗜性病毒，但结果各家报道不一。针对体外转导阳性细胞少的特点Matsuda等[12]在插入的外源基因中接入编码细胞集落刺激因子和鼠雌激素的嵌合序列作为选择性扩增基因。然后在培养物中加雌激素刺激，可以获得高产量的阳性转导细胞。有研究者通过在外源基因中导入绿色荧光蛋白（GFP），利用它的荧光特性筛选阳性转导细胞，然后将筛选得到的带有外源基因的造血干细胞进行移植，也间接提高了转基因效率[13]。
1.4 慢病毒载体
虽然逆转录病毒应用很广，在长期研究过程中其转录效率也得到了提高，但是一直以来逆转录病毒对于大动物和非人灵长类的转基因率都很低，且未能有效克服。为此，近年来人们又将目光转向一种对人类和大动物有较强感染力的病毒载体－慢病毒载体。慢病毒是逆转录病毒中的一种特殊类型，以HIV-1型为代表。慢病毒可以感染静止期的细胞，因此从理论上推测慢病毒应当具有高于逆转录病毒的静止期细胞转基因效率，大部分的研究结果也与这一推论一致。Uchida等[14]用假型的HIV载体转导新鲜分离的人造血干细胞获得高效率，并且高于同一条件下以鼠白血病病毒为载体的转导效率。Miyoshi[15]将慢病毒载体转导的造血干细胞植入NOD/SCID小鼠获得了长期的表达。但也有研究者发现在不用任何细胞因子刺激的情况下，慢病毒并不显示高于一般逆转录病毒的转导效率。对造血干细胞细胞周期的分析发现用目前方法分离得到的造血干细胞多数是处于G0期，而通常的静止期细胞则多数处于G1/S期。由此有人提出应用慢病毒载体转导造血干细胞时也要进行预刺激。
由于HIV的众所周知的致病性，要将其真正用于基因治疗必须经过改造。Douglas等[16]用VSV-G包被人免疫缺陷病毒，并在转入基因上接入启动子等元件，不仅增加了 生物 安全性，而且提高了表达，在转入SCID小鼠后获得了外源基因的高表达。为了提高慢病毒载体的生物安全性，Woods等[17]进行了大量的工作，他们把HIV病毒的3’端LTR去除了400个bp的 核苷酸 ，制成一种可以自身灭活的慢病毒载体，并建立了一系列的包装细胞系来提高其转导效率，而降低致病性，制成了新一代的慢病毒载体用于造血干细胞的转基因。他们研制的慢病毒载体可以有效地转基因到小鼠的造血干细胞，将转导后的造血干细胞植入到NOD/SCID小鼠，并且从这些小鼠的骨髓分离出造血干细胞再植入第二代小鼠后仍有外源基因表达。有的研究避开对人致病的HIV,采用非灵长类动物的免疫缺陷病毒作为转基因载体转导未经刺激的造血干细胞也取得了初步的成果。各方面研究证实HIV病毒是一种有效的转基因载体，如果进一步加以改进，必将成为造血干细胞介导转基因治疗的理想载体。
