材料与仪器
步骤
基本方案 过 利 斯 特 氏 菌 刺 激 制 备 腹 腔 巨 噬 细 胞
材 料
单核细胞增多性利斯特氏菌
无 菌 PBS
H -2 相 合 小 鼠（见 表 A .2A .1)，包括正常和提前 3 周注射了利斯特氏菌的小鼠
V冰浴的 D M E M 培养基
3 % (V A O 乙酸
0.4% (m /V ) 台盼蓝染液
V D M E M -1 0 完 全 培 养 基（室温以及 37°C )
7 0 % (V7 V ) 乙醇
IOml 和 30m l 的注射器以及 23 G 针头
离心机
9 6 孔培养板
移液器
显微镜
1 . 在 50m l 离心管内将利斯特氏菌用 P B S 稀释至合适浓度，此 时 0.5〜1.0m l 菌液中含半数致死量 5 % 〜1 0 % 的 细 菌（一 般 情 况 下 C B A /J 小 鼠 或 C 57B L / 6 小 鼠 需 IO5 个细菌/m l ， B A L B /c 小鼠需 IO4 个细菌/ml)。盖紧离心管盖后摇匀。用 IOml 注射器抽取稀释过的上清。
2 . 用 23 G 针 头 将 0.5〜1.0m l 细菌悬液注射人 H -2 相合小鼠腹腔。根 据 步 骤 6 计算出制备足够用细胞所需小鼠数量。
3.7〜Ild 后 收 集 腹 腔 细 胞（单 元 6.1)。用 冰 浴 的 D M E M 收集细胞以防止巨噬细胞黏附在管壁上。
4 . 将收集的细胞悬液置于 50m l 离心管， 4°C ， 400〜500 g 离 心 lOmin，收集细胞并重悬于 0.5m l 预 冷 的 D M E M 中。
5 . 吸取少量细胞悬液并以 1 : 5 (W F ) 悬 浮 于 3 % 的乙酸溶液中，以溶解红细胞。加入等量的台盼蓝染液并计数活细胞（见 附 录 3C ，细胞数量应达到 I X l O 7〜2 X 107 个
细胞/ml)。
6 . 在离心管内加入 D M E M -1 0 完全培养基，将细胞浓度调节至 2X 106个细胞/m l 。如果血清浓度达不到 8 % 〜9 % ，可离心细胞弃上清后直接用 D M E M -I O 完全培养基稀释
至 2 X 106 个细胞/ml。将腹腔细胞转移至 9 6 孔培养板培养， IOUl/孔（2 X 105 个细胞/孔）。
7.37°C 培 养 2 h 或 稍 长 时 间（但不可过夜）以便巨噬细胞贴壁。
8 . 用多道移液器反复轻柔地吹打细胞，吸弃悬浮细胞后加入 37°C 预 热 的 D M E M -I O 完全培养基。注意操作宜轻柔且不能触碰到贴壁细胞。
9 . 在显微镜下检查细胞。分离的细胞若在 I d 内使用，就无需用 IFN-7 进一步活化。
备 选 方 案 1 连续注射利斯特氏菌和豚蛋白胨后制备腹腔巨噬细胞
此法可以较前法制备更多数量的小鼠腹腔巨噬细胞，但需要给小鼠多注射一次，且需要在更短的时间内收集巨噬细胞。此过程与前述基本方案基本相同，只是在初次注射细 菌 7〜IOd 后 ，直接给小鼠腹腔一次性注射 I m l 高压灭菌消毒的溶解于水的 1 0 % (V /V )豚蛋白胨。 3d 后如前述收集细胞（见基本方案，步 骤 3〜9)。
辅 助 方 案 1 小鼠腹腔注射用利斯特氏菌的制备
材 料
4 只 小 鼠（如 C B A /J)
培养单核细胞增生性利斯特氏菌（见 单 元 6. 6)
无 菌 PBS
I O O m m 无菌脑心浸液琼脂板
无菌脑心浸液培养基
细菌冻存液：溶 解 于 P B S 的 2 0 % (V /V ) 甘油，蒸汽消毒后 4°C 保存
70um 无菌尼龙滤网
50m l 离心管
无菌细菌涂布器
37°C 培养箱
无菌接种环
560n m 分光光度计
高速离心机以及无菌带盖离心管
Sorvall R C -5 离心机及 G S A 转子
I m l 冻存管
1 . 将适量利斯特氏菌注射至 2 只小鼠腹腔，以便通过体内途径获得利斯特氏菌并确保其毒力。如 对 于 C B A / J 小 鼠 ，可 使 用 IO6 个细菌/鼠。 2d 后处死小鼠，取出脾脏并制备脾细胞悬液，通 过 70 Mm 无菌尼龙滤网后将细胞置于 50m l 离心管。另 取 2 只小鼠作为对照。
也可以不通过体内传代，直接从脑心浸液琼脂板挑取利斯特氏菌克隆，参照步骤 3 接种至脑心浸液肉汤。
2.用 P B S 梯度稀释脾细胞悬液（1 : 10、 1 : 100、 1 : 1 0 0 0 ) 并 将 IOOm I 各组稀释细胞悬液分别置于 I O O m m 无菌脑心浸液琼脂板，用无菌细菌涂布器将细胞涂布均勻。置于 37°C 培养箱培养过夜。计数每块培养板的克隆数。确认涂布对照小鼠脾细胞板不形成克隆，且涂布实验小鼠脾细胞板形成大量克隆（对 于 1 : 1 0 0 稀释的细胞，每块培养板应获得 10〜100 个克隆）。
3 . 用接种环从培养板挑取 4 个 典 型 克 隆 并 分 别 转 移 至 20m l 无菌脑心浸液培养基中(50m l 离心管）。注意每次挑取克隆时接种环均需灭菌。加盖混匀。
4a. 制备当天细菌培养物：将 试 管 置 37°C 培养，每 30m i n 摇动一次。 3 h 后 ，定 时（比如每小时）取少量菌液通过分光光度计检测其 O D 值 。当 O D 值均达到 0.17 时停止培 养（约 需 4 h)，从中取一管再扩增。
4b. 制备隔夜细菌培养物：将 试 管 于 37°C 静 置 培 养 过 夜（试管盖无需盖紧）。第二 天 ，将试管内的菌液以 1 : 1000 稀释至无菌脑心浸液培养基，培 养 至 O D 值 达 到 0.5〜1.0 (约需 8 h)。
5 . 将菌液置 4°C 保 存（每 份 0.5 ml)。如方便，可于第二天确认培养物中是否含有利斯特氏菌。此外 ，利斯特氏菌能在 4°C 存活并扩增。对于隔夜培养的细菌，进 入 步 骤 7操作。
6 . 经过筛选后，将含有细菌的 15〜130m l 脑心浸液培养基转移至无菌高速离心管，将其固定在摇床的样品架上，在 37°C 缓慢摇动培养，定时检测 O D 56c 5 值 ，并 在 O D 56。值达 到 0.5〜L O 时 停 止 培 养（约 需 5 h)。
7.700g离 心 细 菌 6 min。在此过程需非常小心：因为培养物里含有大量细菌。将细菌悬 浮 于 IOml 冻存液中。
8 . 检测细菌的 O D 56。值（可 通 过 1 : 2 0 稀释后检测），将细菌的浓度调节至 I X l O7〜IO8个细菌/ml (O D 56。值 为 1 时细菌量约为 5 X 108)。将 细 菌 分 装（0.1〜Iml) 保存于一80°C ，可以保存 3 年以上。每次解冻后使用，应避免反复冻融。
备 选 方 案 2 Con A 刺激的腹腔巨噬细胞的制备
此方案中不使用致病菌，但巨噬细胞获得率较低。将 Con A 溶 解 于 PBS (200ul/ml) ，用 0.22/xm 的滤器过滤，然后保存于 一 20°C 。 每只小鼠腹腔注射 500ul (IOOug)C o n A (附录 2E ) ， 4d 后收集腹腔巨噬细胞（见基本方案，步 骤 3〜 9) 。
备 选 方 案 3 骨髓来源的巨噬细胞的制备
附 加 材 料
10% ( V A O L929 细胞条件培养基（见辅助方案 2)，溶解于 D M E M -10 完全培养基
0.05% (V /V ) 胰蛋白酶/0.53m m o l / L E D T A
100U/ml (lOng/ml) 重组小鼠 IFN- 7 , 溶 解 于 l 〇 % L 929 条件培养基
5m l 注射器和 25 G 针头
I O O m m 无菌培养皿
IOml 无菌吸管
70p m 无菌尼龙滤网
细胞培养皿和培养瓶（可选用）
9 6 孔平底培养板或 2 4 孔培养板或 I O O m m 细胞培养皿
1 . 处 死 小 鼠（附 录 2 G )，取出股骨并去除肌肉（单 元 6.1)。
2.剪断股骨，通 过 5m l 注 射 器 和 25 G 针 头 用 4 ml 1 0 % L 929 条件培养基冲洗出骨髓，将骨髓收集至无菌 I O O m m 细胞培养皿。
3 . 用 IOml 无菌吸管反复吹打细胞团块，将细胞悬液通过 70 Mm 无菌尼龙滤网。
4.取部分细胞悬液以 1 : 5 悬 浮 于 3 % 乙酸，以溶解红细胞。加 入 等 量 的 0 . 4 % 台盼蓝染液计数活细胞。据此 用 1 0 % L 929 条件培养基调节细胞浓度至 IO6 个细胞/ m l 。
5a 扩增细胞：将细胞置于培养皿或培养瓶中培养 7d ，用 0.05% (V A O 胰蛋白酶/0.53 mmol/L E D T A 消化，收集细胞并以 5 X IO4〜IO5 个细胞/孔 置 于 9 6 孔培养板
中培养。
5b. 不扩增培养：将细胞置于培养板：
9 6 孔培养板： 0.2m l 细胞悬液/孔
2 4 孔培养板： I m l 细胞悬液/孔
I O O m m 培养皿： 12m l 细胞悬液/个
6.对于扩增的细胞，继续培养 1〜2d 直至细胞汇合。对于未扩增培养的细胞需培养 5〜7d ，用 1 0 % L 929 条件培养基每 2 天换液。
7 . 为了增强抗原呈递效率，可在抗原呈递实验前 4 8 h 用 l O O U / m l 溶 解 于 1 0 % L 929 条件培养基的重组小鼠 IFN-y ( l O n g / m l ) 处理细胞。
辅 助 方 案 2 制 备 L9 2 9 条件培养基
材 料
贴壁培养 L 929 细 胞（A T C C 细胞株号 C C L l )
V 无 菌 P B S ，室温
0 . 0 5 % (W V ) 胰蛋白酶/O.53 mmol/L EDTA
V D M E M -IO 完全培养基
15m l 离心管
Sorvall RT- 6 0 0 0 冷冻台式离心机及 HB-IOOO 转子
培养瓶
0.45um 滤膜
1.在 25 cm2 培 养 瓶 中 培 养 L 9 2 9 细 胞 ，当细胞处于对数生长期并汇合生长时吸弃上清(10 ml)。加 入 3m l 室 温 无 菌 P B S ，摇 动 培 养 瓶 后 静 置 lmin，轻轻摇动一次后吸弃 P B S 。
2.加入 3m l0 . 0 5 % (V /V ) 胰蛋白酶/0.53 mm 〇 l/L E D T A 静 置 5 min。 盖紧瓶盖，拍打培养瓶使细胞脱落，也可在显微镜下观察细胞脱落情况
3 . 加 入 IQml D M E M -I O 完 全 培 养 基 并 将 细 胞 悬 液 转 移 至 15m l 离 心 管 ， 4°C ， 400〜500 g 离 心 lOmin，吸弃上清后，将细胞悬浮于和原培养基等量的 D M E M -10 完全培养基中。
4 . 将细胞悬液用 D M E M -I O 完全培养基作 1 : 1 0 (W V ) 稀释并转移至适当大小的培养 瓶 中（0.4m l 细胞悬液/c m 2 培养瓶）。继 续 37°C 培养直至细胞汇合，一般需要一周 。
5 . 收集细胞上清，用 0.45p m 滤膜过滤并分装成每份 1〜15m l ，置一 20°C 冻存。
备 选 方 案 4 制 备 LPS 刺 激 的 B 细胞
材 料
悬 浮 于 D M E M -I O 完全培养基中的脾脏细胞悬液（单 元 2. 1)
x/ D M E M -10 完全培养基， 37°C
LPS (如 Difco 或 Sigma)
I O O m m 细胞培养皿
50m l 无菌离心管
Sorvall R T - 6 0 0 0 冷冻台式离心机及 H B - I O O O 转子
75 cm2 细胞培养瓶
1 . 用 A C K 红 细 胞 裂 解 液（单 元 2 . 1 ) 去除脾细胞悬液中的红细胞。
2 . 将细胞悬浮于 D M E M -I O 完全培养基，计 数 活 细 胞（附 录 3 0 , 调节细胞浓度至 5 XIO6个细胞/ml。
3 . 将细胞转移至 I O O m m 细 胞 培 养 皿（IOml/培养皿）中，并 在 37°C 培 养 2 h ，轻轻摇动培养瓶后，将悬浮细胞转移至 50m l 离心管。
4 . 室温， 200〜300 g 离 心 lOmin，吸弃上清，将细胞再次悬浮于预热的 D M E M -I O 完全培养基，计 数 细 胞（附 录 3 0 , 调节细胞浓度至 2 X 106 个细胞/m l 。
5 . 加 入 L P S 至终浓度 10 Mg/m l 。将细胞悬液转移至 75 cm2 细胞培养瓶或 I O O m m 细胞培养皿 ， 37°C 培 养 48 h 。
6 . 轻轻摇动培养瓶使非贴壁细胞悬浮，将细胞悬液转移至 50m l 离心管， 200〜300 g 离心 lOmin，吸弃上清，将细胞再次悬浮于 D M E M -1 0 完全培养基。
7.200〜300 g 离 心 lOmin，吸弃上清，将细胞再次悬浮于预热的 D M E M -1 0 完全培养基 ，计数细胞，调节细胞浓度至 2 X 106个细胞/m l 。这些细胞就可用作非贴壁的抗原 呈 递 细 胞（单 元 7. 2)。
来源：丁香实验
