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    干细胞与基因治疗

    相关实验：干细胞与基因治疗

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    病毒介导的基因转导实验技术

    逆转录病毒介导的基因转导

    目 前 在 基 因 治 疗 中 较 为 常 见 的 是 由 M oloney 小鼠白血病病毒 (MoLV) 改建的各类逆转 录 病 毒 载 体 ，保 留 了 顺 式 功 能 结 构 ，而敲除了 DNA 基 因 结 构 中 的 即 g 、 三部分 致 病 性 的 反 式 功 能 序 列 ，并 以 外 源 基 因 替 代 空 白 区 ，故 为 缺 陷型病毒，缺乏逆转录病毒 的 结 构 基 因 区 ，不 能 编 码 结 构 蛋 白 ，不能包装成子代病毒颗粒。包装细胞为小鼠成纤维 细 胞 系 NIH3T3 转染各种不 同 的 辅 助 病 毒 所 构 成 ，可为逆转录病毒载体提供结构蛋白组 分 ，因而二者相互补偿、结 合 ，就能够包装成子代的病毒颗粒。由于这种病毒颗粒仍然 是 重 组 的 逆 转 录 病 毒 载 体 DNA，这种子代病毒颗粒与野生型逆转录病毒颗粒的遗传物质不同，故称假病毒颗粒，以出芽的方式从包装细胞膜上进入其培养上清中。逆转录病毒包膜中的蛋白质成分含有 M V 基因表达的一种糖蛋白，而许多哺乳动物细胞有识别这种糖蛋白的特异性受体，二者结合可介导逆转录病毒进入宿主细胞，并有效地整合在宿.主细胞染色体 D N A 中。

    在逆转录病毒载体的外源基因中包括目的基因和标记基因，标记基因一般为新霉素耐药基因 、潮 霉 素 基 因 和 嘌 呤 霉 素 基 因 等 ，但 多 数 用 基 因 ，故可用G 418 对转染后的包装细胞进行筛选与克隆。

    材 料 与 试 剂

    ⑴适当的包装细胞系 (PA317)及 含 10%胎牛血清的D M E M 或 R PM I1640完全培养基。 (2) G 4 1 8 的配制：取 IOOmg G 4 1 8 溶 于 2 m l重蒸水(50m g/m l)中 0 .2 2 p m 微孔滤过滤 除菌，分装- 2 0 1 保存备用。 ( 3 ) 聚 凝 胺 Polybrene(储液浓度为〇 .8g/ml)是一种多价阳离子，可降低病毒与细胞膜 之间的相互排斥，有利于增加病毒的感染效率。 Polybrene(Sigm a)储 液 浓 度 为 0.8g/m l， 0 .2 2 )im 滤膜过滤除菌， - 2 0 1 保存。使用终浓度为8)ig/ml。 ⑷ 2x H B S :取 1.6g N a C l ，0.074g K C l ，0.027g N a 2H P 0 4 • H 2O ,0.2g 葡萄糖，IgHEPES 溶 于 90m l 重蒸水中，用 0.5mol/L N a O H 精确调整p H 为6.95~7.05,然后用重蒸水定容 至 100m l ，用0.22叫1滤器过滤除菌，分 装 5ml/瓶 ，储于-20T 备用。此溶液中各组分浓 度分别为 280nmol/L NaCl、 10nmol/L K C 1、 1.5mmoI/L Na2HP〇 4、 12mmol/L 葡萄糖、 50mmol/L H E P E S 0 ( 5 ) 2 m o l/L C aC l2 : 取 1 0 .8 g C aC l2 .6 H 2O 溶于 20ml 蒸馏水， 0.22叫!滤膜过滤，分 装 Iml/瓶 ， -20T 保存备用。 (6) 阳离子脂质体转染试剂(如Lipofectin™ 试剂)

    实 验 内 容

    重组逆转录病毒载体的包装及克隆筛选

    1 ) PA ： 317 、 N IH 3 T 3 细胞的培养
    复苏方法：从 液 氮 中取出后于 3 7 1℃水 浴 剧 烈 振 摇 lmin，吸出细胞悬液入离心管，再 滴 加 8〜 IOml 培养基， l 〇〇〇 r/min 离 心 5 min，弃上清，用适量培养基 (含 10% 胎牛血清，2mol/L 谷氨酰胺， l 〇〇 U /m I 青 霉 素 和 lOOpg/m l 链 霉 素 的 D M E M 培养基) 稀释后接种入培养瓶中培养，次日换新鲜培养基，以后每 2〜 3 天换一次，细胞长满后根据需要传代。

    传代方法: 彳顷去培养基，用 P B S 液洗一次，加入胰蛋白酶消化液 (50m l 培养瓶加 0.5m l ，IOOml 培 养 瓶 加 lml)，轻轻晃动培养瓶，室 温 或 3 7 ℃ 置 l——3 min，加适量有血清培养基以终止反应，滴管反复吹打使细胞脱落成细胞悬液，将细胞悬液按所需密度接种入新的培养瓶中，于 37℃、 5 % C 0 2 的培养箱中培养。

    2) G 148 对 于 P A 3 1 7 细胞的最小致死量的测定

    2 4 孔 板 接 种 适 量 的 P A 3 1 7 细胞。细 胞 长 成 5 0 % 〜 6 0 % 汇片时，加入含有不同浓度G 418(0_2 g/L 、 0.3 g/L 、 0.4 g/L 、 0.5 g/L 、 0.6 g/L 、 0.7 g/L 、 0.8 g/L ) 的选择培养液。每 2〜 3 天换一次液，一周左右根据细胞死亡情况确定 G 418 对 于 P A 3 1 7 的最小致死量。
    3 ) 重组逆转录病毒载体质粒转染包装细胞P A 317 将外源基因导入P A 317细胞的方法有多种，如磷酸钙共沉淀、电穿孔和脂质体介导 的基因转染等几种方法，磷酸钙共沉淀的转染效率较低，已较少使用□电穿孔适用于质 粒片段较大的情况。P A 317细胞耐受电击的能力很强，有实验者对其进行了从200〜 1800V 不等的电击，细胞都能存活。最常用的是脂质体法。 (1) 磷酸钙介导转染P A 317细胞。 质 粒 D N A : 经苯酚/氯仿反复抽提或玻璃奶纯化， （9Z W <9D 280=1.8,用前除菌。 细胞:取旺盛生长期的P A 317细胞以(1〜 2)xl〇5细胞/孔 ，接 种 6 孔 板 ，37T 、5 % C 0 2、 饱和湿度培养24h , 待用。 细胞处理：取 已 长 成 7 5 % 汇片的单层细胞，用新鲜的、无 血 清 D M E M 营养液洗涤 2 ~3 遍 ，换上新鲜生长液(p H 7. 2~7. 4)。 磷酸钙/D N A 共沉淀物的制备：将重组逆转录病毒载体D N A 溶 于 0.1xTE(p H 8.0)中， 制 成 0.02〜 0.04g/L 溶 液 ，取 43 8 0 与 62|il CaCl2混合制成溶液A ，将 500叫 2x H B S 的 B 液逐滴小心加入A 液管中，室温作用20~30min，即可见细小沉淀形成。 细胞/沉淀物作用：将沉淀物用吸管轻轻吹打一次，转移至上述细胞的培养液中，轻 轻晃动，使沉淀物与营养液混合均匀，溶液呈混浊状， 37T ：、 5 % C 0 2、饱和湿度培养。 (2) 电穿孔法转染P A 317细胞： a. 培 养 P A 3 1 7 细胞至对数生长中期， 0 . 2 5 % 胰酶消化，收 集 P A 3 1 7 细胞。以低 血清或无血清的D M E M 重悬细胞，制 成 IO7个/m l 的细胞悬液。 b. 重组质粒无菌化处理后，用 无 菌 H B S 溶 解 为 aipg/Ml。 c•混合IO7个/ml P A 3H 细 胞 与 10〜 2〇| u g 的重组质粒，将混合物转移到电转杯内。 冰 浴 IOmin0 d•设定电击条件：如 250V 、 950|liF ，电 击 25〜 30(is。随 后 冰 浴 lOmin。 e. 将电转杯内的P A 3I7 细胞转人培养瓶中，孵箱内培养。 24h后换液，加入无双 抗 的 D M E M 培养液，另 加 入 G 418筛选培养。 (3) 脂质体介导法转染P A 317 细胞 a. 质 粒 D N A : 经苯酿/氯仿反复抽提或玻璃奶纯化， O D 260ZOD28g= 1. 8 ,用前除菌。 b•细胞：取旺盛生长期的P A 317细胞以(l~2)xl〇5细胞/孔 ，接 种 6 孔板， 37^ 、 5 % C 0 2、饱和湿度培养24h ，待用。 c. 细胞处理：取 已 长 成 7 5 % 汇片的单层细胞，用新鲜的、无 血 清 D M E m 营养液 洗 涤 2~3遍 ，换上新鲜生长液(PH 7.2〜 7.4)。 d. 脂质体/DNA 复合物的制备:在500(i l 无 菌 Eppendorf管中配液。A 液 :将 l ~2(ig DNA稀 释 于 1 0 0 4 无血清、无 双 抗 DMEM营养液中。B 液 :将 2〜 2〇 m1Lipofectin 稀 释 于 IOOmL 无血清、无 双 抗 DMEM营养液中，室温 放 置 30~45min。混合八、 B 液 ，轻微振摇混勻，室 温 孵 育 10〜 15min。此时如果溶液浑池，不影响转染； 如果溶液有沉淀，则停止转染。 e. 细胞/沉淀物作用:将沉淀物用吸管轻轻吹打—次 ，转移至上述细胞的培养液中， 轻轻晃动，使沉淀物与营养液混合均匀， 37T：、 5 % C0 2、 饱和湿度培养5~24h 。 注意：影响脂质体介导法转染效率的主要因素有几种：①适当的质粒和脂质体比例。
    置冰上备用。时间间隔长时，可浓缩保存。 2)病毒液的浓缩与保存 (1)收 集 48h 培养制备的各代病毒液于消毒过的培养瓶内，〇.22|j m 滤膜过滤。 ⑵可用差速离心法浓缩病毒上清，具体步骤为： 4t 、 1000r/min(250g)离 心 15min。 弃沉淀，将 上 清 液 于 4 1 、 3500r/min(730g)离 心 2h ，即为重组病毒液，加 入 Polybrene 至终浓度郎g/m l ，分装， - 7 0 ¾ 保存备用。 (3) 如不需浓缩可将过滤好的病毒液分装Eppendorf管内，每 管 lml，用封口膜封好， 于- 7 0 ¾ 冰箱或液氮中保存。 (4) 病毒 可 在 3 7 ¾ 水浴复苏，立即使用。②转染时间。 质 ^ 质 粒 复 合 補 染 織 的 时 财 2~ 施 ，錄 她 以 6〜 8h 最为适合。 可以获得最好的效果，时间过少转染不充分，时间 起 状 态 差 ，不利于随后的筛选工作。③转染细胞的数 时— 田胞接种的德度也较为关键。密度太低或太高均会影响转染效率 数生长期且代谢活跃的细胞具有较高效率，同时转染 4)G4 1 8 抗性克隆的形成与筛选 (1)包装细胞抗性克隆的形成： & 〜 72h 后 ，包装细胞可形成单层，用胰酶消化后按 3 传 代 于 6 孔板内，職 培 养 到 胞 密 度 达 5〇%~70%融合。 b，胞 生 长 倩 况 可 酌 情 增 加 5CMGOpgZm l G 4 1 8 的 训 D M E M 8 ，增 至 咖 培养液进行筛选，每天视细 8 最 小 致 死 量 浓 瓶 3〜 5 纖 纖 量 的 議 轉 液 。同时用 a 的 ^ t 、、、 第 f i *5K M 天 ，非转染的包装细胞开始死亡 4 天 后 只 剩 下 隨 不 細 转 染 麵 ，其余全部 (可见未加转染液 1G〜 14邱 藏 隸 嫩 的 最 懿 1 a.笔你记准确。 S 已 =隆 的 培 养 皿 置 于 显 微 镜 下 观 察 克 隆 位 置 ，并将各个克隆位置用标记 b•在超净台内弃去培养皿内的培养液。 C. 子f 取一块已高压的滤纸，用 0. 2 5 % 胰蛋白酶消化液浸润，置于所标记克 d. n 土 i 养 = 择 培 养 基 如 ，用慑子取出已黏附克隆细麵滤 纸1 ，置于一个孔中的培养基中，涮洗滤纸片数次，以使黏附的细胞脱下镱下 观 确 认 细 胞 已 脱 落 后 ’将滤纸片去掉，将 雄 细 胞 置 于 培 养 箱 中 培 养 “ 天 、^ 待细胞长满后， 0.25%胰蛋白酶消化，并将细胞转移至6 孔板继续 。 注意：用 滤 纸 片 綱 t 细胞克隆时间要适肖，时 间 短 可 导 致 克 隱 附 曰 ^ 黏附到滤纸洗脱后仍为娜块而不是分散状态。时 间 长 则 导 致 織 变 性 或 死 _ ^ ，’ 13.2.1 _2.2重组逆转录病毒毒液制备与保存 I) G4I8 抗性细胞克隆扩增后病毒上清的制备 大培养的G 418抗 性 细 胞 雄 ，在收毒前—天 将 细 胞 1 : 3 或 1 :4 转 代 待 产 象 胞 ^ 长 至 5〇%〜 9〇%汇片时(16〜 24h)，弃去培养液，加人半量的、新鲜的完全i立’养液 12h 滴度的逆转录病毒上清至少要等到转染后施。此时，可以口每间 户 清 直 至 转 染 后 72h，这期间病毒的滴度不出现显著下降。如果细胞在转染 未铺洒，就不大可能生产出尚滴度的逆转录病毒上清 f 二 仍 这 样 得 到 高 滴 度 _ 毒 上 清 輕 等 到 瓜 以 后 。细胞在转染后 ⑵ 转 染 后 大 约 48h 收获病毒上清。如 果 在 ^ 内 使 趣 转 录 病 毒上清，可将其

    重组逆转录病毒的滴度测定

    置冰上备用。时间间隔长时，可浓缩保存。 2)病毒液的浓缩与保存 (1)收 集 48h 培养制备的各代病毒液于消毒过的培养瓶内，〇.22|j m 滤膜过滤。 ⑵可用差速离心法浓缩病毒上清，具体步骤为： 4t 、 1000r/min(250g)离 心 15min。 弃沉淀，将 上 清 液 于 4 1 、 3500r/min(730g)离 心 2h ，即为重组病毒液，加 入 Polybrene 至终浓度郎g/m l ，分装， - 7 0 ¾ 保存备用。 (3) 如不需浓缩可将过滤好的病毒液分装Eppendorf管内，每 管 lml，用封口膜封好， 于- 7 0 ¾ 冰箱或液氮中保存。 (4) 病毒 可 在 3 7 ¾ 水浴复苏，立即使用。

    腺 病 毒 介 导 的 基 因 转 导

    构建重组腺病毒需要三个基本条件：① 病 毒 衣 壳 D N A ，常 用 如 pAdEasy; ②一种 A d 表达质粒如pAd-Track、 p J M 1 7 , 该质粒携带有基因表达元件，可插入目的基因，并 带有与缺陷病毒衣壳D N A 互补的病毒序列；③ 一 种 E l 区缺陷互补的人胚胎肾细胞系 H E K 293 细胞。
    有缺陷病毒衣壳D N A 病毒带有必需的关键序列(复制起始子和D N A 包装序列)，它 与腺病毒质粒 P A d - T m c k — 起作用，病 毒 衣 壳 D N A 与插入的超出腺病毒包装长度限制 的质粒序列互补，这 些 D N A 序列共转染进入E l 区互补的H E K 293细胞后，表达质粒与 病 毒 D N A 在序列重叠区发生同源重组，重组一旦发生，就具备了病毒完成一个感染周 期需要的条件：早期基因表达导致D N A 复 制 ，随后晚期基因表达，最后病毒包装成重 组腺病毒(图13.5)。

    材 料 与 试 剂

    ⑴ 人 胚 肾 ( H E K 2 9 3 ) 细胞系及含 1 0 % 胎牛血清的 D M E M 完全培养基。 (2) G 4 1 8 的配制：取 IOOmg G 418溶 于 2m l 重蒸水(50m g /ml)中 0. 22叫 1 微孔滤过滤 除 菌 ，分装-20T 保存备用。 ⑶阳离子脂质体转染试剂(如 L i p o f e c t i n ™试剂)。 ⑷ 溶 液 A :l% 组织培养琼脂糖，髙压灭菌后，冷却 至 42弋保温备用。 溶 液 B :2x D M E M 、 2x抗生素、 5 % 胎牛血清混合物， 37T 保温备用。 ( 5 ) 病毒储存液： 0.1mol/L Tris • H C l ( p H 7 . 5 ) 0.25mol/L N a C l l m g / m l B S A 5 0 % 甘油 甘油高压灭菌，其他溶液过滤或高压灭菌。 (6) P B S 0 (7) 不 同 浓 度 CsCl(氯化铯)溶液的配制：用 P B S 配 制 密 度 为 1.5g/ml、 1.35g/m l 和 1.25g/ml 的 CsCl 溶液。 注意：吸入、摄 入 CsCl或经皮肤吸收CsCl均有害，配制时戴手套及护目镜。

    实 验 内 容

    将目的基因插入腺病毒穿梭质粒

    通过基因操作将目的基因 (Y F G ) 插入到腺病毒穿梭质粒 (PAdtrack-C M V ) 的多克隆位点 ，然后重组子转化大肠杆菌 D H 5a ，对阳性重组子进行 P C R 及酶切鉴定。具体试验步骤略。

    重组腺病毒 pAd-Y F G 构建

    脂 质 体 如 LipofectAMIN介导线性化pAdtrack-CMV-YFG)和 pAdEa吵-1(重组腺病毒 穿梭质粒pAdtrack-CMV-YFG和 pAdEasy-1经 Pad[酶切线性化)共 转 染 293细胞。 (1)将 2 9 3 细胞接种于6 孔培养板， 4.5xl〇5个/孔 ，培 养 24h 后用于共转染。每 块 6 孔板准备以下试剂。 A 液 ： l 〇ngDNA(4jiigpAdtrack-CMV-YFG 和 6|agpAdEasy-l,或其他比例)， 以不含 抗生素和血清的DMEM稀 释 至 300叫。 B 液 ：取 2〇 0LipofectAMIN，取无抗生素和血清的D M E M 280|al，室温放置 5 m i n 。 C 液 ：将 A 液 和 B 液轻轻混匀，室温放置 2 0 m i n 。 ⑵ 用 无 抗 生 素 和 血 清 的 DMEM将 293细 胞 洗 2.〜 3 次 。 (3)取 5.4m l 无抗生素的D M E M 加入到C 液中，混匀，加 入 6 孔板的各孔中， 继续培养

    ⑷ 培 养 6h 后更换含5 % F B S 的 D M E M ，继 续 培 养 10〜 2 0 天 ，2〜 3 天换一次培养液。 (5)培 养 至 第 12〜 14天时，一般会出现明显的细胞溶解现象(cyt〇 pathic effect, CPE), 如 图 13.6所示。此 时 ，回收细胞， —7〇弋保存，或-7〇 t 、 37丈反复冻融3 次 ， 5〇〇〇 r/min 离 心 IOmin取上清， - 7O^C保存备用。 注意 ：反复冻融后大量的病毒颗粒仍然留在细胞内，但是再冻融会降低病毒滴度。

    单克隆重组腺病毒筛选及阳性鉴定

    (1) 将 2 9 3 细胞接种于 6 孔板中，待细胞达到 80% 融合时，进行下一步。

    (2) 将重组病毒上清以 10 倍 比 稀 释 于 Iml 无 血 清 的 D M EM 中 ，吸 弃 293 细胞上清，加入病毒稀释液， 3 7 ℃ 孵 育 lh。
    ⑶ 准 备 铺 琼 脂 ： 溶 液 A :l% 组织培养琼脂糖，高压灭菌后，冷 却 至 42丈保温备用。 溶 液 B :2x D M E M 、 2x抗生素、 5 % 胎 牛 血清混合物3冗保温备用。 将 溶 液 A 和 溶 液 B 等体积混合，注意不要产生太多气泡。吸弃第二步293细胞培养 液 ，每 孔 加 人 3m l 溶 液 A 和 溶 液 B 的混合溶液，室 温 放 置 30m i n 使其凝固。放 回 ^ cc 培养。 注意：①琼脂凝固较快，操作要迅速； ② H E K 2 9 3 单层细胞容易从平皿上脱落，铺 板时应让谅脂从平皿边沿慢慢流下扩散，整个平皿铺满后，将剩余的琼脂盖住残’留的 D M E M ( D M E M 通常在平皿中聚集成一个斑点)， 这可以防止铺板后软性斑点的出现； ③ 3 ~ 5 天 后 ，不用染色，肉眼可见噬菌斑，野生型病毒噬菌斑一般直径为^ 3mm 重组型噬菌斑会小得多。 ⑷ 培 养 3 ~ 5 天 后 ，在其上再铺一层含有中性红的琼脂，每孔加入2ml。 ⑶ 第 7〜 8 天 ，镜下观察病毒空斑的形成，用吸管挑取单个空斑于l m i 的 D M E M 液 中 ， -70T ：、 37T 反复冻融3 次 ， 5000r/m i n 离 心 IOmin取上清。 (6)取上清再次感染2 9 3 细胞，当细胞出现C P E 时 ，回收细胞；反复冻融离心取上 清 用 于 病 毒 基 因 组 D N A 的提取。① 取 上 清 370叫 ，加 16|ul E D T A (0.5mol/L )、 100 S D S (20%)、 8 0 蛋 白 酶 K (50ng尔1)， 5 0 ^ 孵 育 2〜 4h ; ② 加 人 440^1酚/氯仿/异丙醇(体积 比 25 : 24 : 1)溶液抽提蛋白， 13 000r/m i n 离 心 25min;③ 取 400|al上层水相溶液，加 40叫 3mol7L N a A c 、 8OOpl无水乙醇，充分混匀后， -7〇丈放置3〇min; ④ 代 、 13000r/m i n 离 心 25min，弃上清，沉 淀 D N A 用 7 5 % 乙醇洗一次，待干燥后溶于50|il去离子水中。以 此为模板进行P C R ，检测重组病毒中是否有插入的目的基因。

    重组腺病毒的扩增与纯化

    (1)将 2 9 3 细胞接种于150m m 瓶皿中，待细胞生长至90 %汇合状态时，加入病毒，感 染强度(multiplicity ofinfection， M O I )约为 10 个空斑形成单位(plaque forming unit， pfu)/个细 胞 ， 36〜 48h 后 ，细胞出现完全C P E 时 ，收集细胞，冻存于-70T ：，待累计多个瓶皿时， 统一纯化病毒。 ⑵ 将 出 现 C P E 的 293细胞- 7 0 ¾ 、 37T ：反 复 冻 融 3 次 ， 2 500r/min离 心 IOmin以除 去细胞碎片。 (3) 制备 CsCl 密度梯度：依次将 〇.5mI 1.5g/ml CsCl 溶液、 2.5ml 1.35g/ml CsCl 溶液 和 2.5ml 1.25g/ml CsCl溶 液 加 入 12ml超速离心管中。 (4) 将冻融后的待纯化病毒液加于各管的C s C l 密度梯度之上， I O t 、 15 O O O g 离心 lh，于 1.35g/m I C s C l 溶 液 和 i.25g/m l C s C l 溶液之间出现白色雾状病毒时收集病毒，并 与 1.35g/m I C s C l 溶液混合； i〇sc、 15〇〇〇g 离 心 識 ，进一步纯化病毒。 ⑶ 吸 出 病 毒 带 ，以 1〜 2 倍体积的H a n k 缓冲液稀释病毒，以 H a n k 缓冲液为透析液 于 4丈透析病毒，每 2h 更换一次透析液，共 换 液 5 次 。 (6)取出纯化的病毒液，力卩无菌甘油至终浓度1 0 % ，分装，_70sc冻存。 注意：病毒毒液可用储存液1 : 1 稀释， -2〇 SC保存

    病 毒 滴 度 测 定

    取 2 0 0 纯化病毒，加 970(^1 Hank缓冲液， IO^il 10% S D S ，混 勻 ，以 9900 H ank缓 冲 液 加 100 10% S D S 为空白对照，测 定 260nm 和 280nm光吸收，读据此估算病毒的滴 度(颗粒数/ml)和纯度。 2 ) 病毒感染滴度(pfu/m l)的测定 取 1 0 0 纯化病毒稀释于9900 DMEM中(IO2倍稀释)，混 匀 后 取 loo# 稀 释 于 9000 DM EM 中(IO3倍稀释)，如此进行系列稀释直至IO12倍稀释；提 前 一 天 将 2 9 3 细胞接种 于 一 块 6 孔培养板，接种量为2xl06个/孔 ； 24~36h 后 ，细胞长至9 0 % 汇合状态时将各孔 中的培养液吸出，分别加入1〇 2~1〇 12倍稀释的病毒液，培 养 1〜 2h 。 快 速 C P E 分 析 ：将 102~106倍稀释的病毒液从各孔中吸出，每孔中加入2m l 含 10% F B S 的 D M E M ; 培 养 36〜 48h 后 观 察 C P E ，选 出 发 生 100% C P E 的稀释倍数；用下列公 式计数病毒感染滴度： 病毒感染滴度(pfu/m l)= (2x l 06个/孔)x 稀释倍数XlO/病毒液体积 噬斑试验：将 1〇 7~1〇 12倍稀释的病毒液从各孔中吸出，每孔中加入3m l培养琼脂(由 等体积的溶液A 和 溶 液 B 组 成 ，见单克隆重组腺病毒筛选及阳性鉴定)；继续培养4~7 天 ，直至噬斑形成。选出噬斑数在30〜 100的稀释倍数，用下列公式计算病毒感染滴度。 病毒感染滴度(pfu/m l)=平均噬斑数X稀释倍数

    慢 病 毒 介 导 的 基 因 转 导

    材 料 与 试 剂
    (1)质 粒 ：慢病毒载体(：-?11\¥阳 01 ^ ，包 装 质 粒 0^^118.2和 包 膜 质 粒 ¥5¥-0。 F U X W : 凝血因子I X 的重组慢病毒表达载体。 F A X W : A B P 肝特异性启动子指导人的凝血因子I X 的重组H I V 载体。 ⑵ 适 当 的 包 装 细 胞 系 ，如 H E K 293人胚肾细胞系和B E K 大鼠肾成纤维细胞分别用 含 10%胎牛血清的高糖D M E M 和 R P M I 1640完全培养基。 (3) 2x H E P E S (H B S ) : 取 1.6g N a C l ， 0.074g K C l ， 0.027g N a 2H P 0 4 . H 20, 0. 2g 葡萄 • 379 • 糖 ， Ig H E P E S 溶 于 90m l 重蒸水中，用 〇.5mol/L N a O H 精确调整p H 为 6.95〜 7.05,然后 用重蒸水定容至100m l ，用 0.22|a m 滤器过滤除菌，分 装 5ml/瓶 ，储于-20T ：备用。此溶 液中各组分浓度分别为 280nmol/L N a C l 、 10nmol/L K C l 、 1.5mmol/L N a 2H P 0 4、 12mmol/L 葡萄糖、 50mmol/L H E P E S 。 ⑷ 2mol/L C a C l 2 : 取 10抑 〇 &( ：12 .6112〇溶 于 20m l 蒸馏 水 ， 0.22叫 滤 膜 过 滤 ，分 装 ImlZ瓶 ， - 2 0 ¾ 保存备用。 (5)聚 凝 胺 Polybrene(储液浓度为〇.8g/ml)是一种多价阳离子，可降低病毒与细胞膜 之间的相互排斥，有利于增加病毒的感染效率。 Polybrene(Sigma)储 液 浓 度 为 0.8g/m l ， 滤膜过滤除菌， -20T 保存。使用终浓度为8ng/ml。

    实 验 内 容

    细胞培养
    293T 细胞用髙糖 DM EM 培养基，培养液的配制方法：DMEM+ 1 0 % 牛血清+100U/ml青霉素+ l 〇〇 U /m l 链霉素。细 胞 传 代 24 h 后 移 去 2 ml(l 〇 Cm 培养瓶) 或 5 ml(15c m 培养瓶)的培养基然后留细胞在培养箱至少 lh。

    B H K 细胞用 164 〇培养基+ 1 0 % 小牛血清+ l 〇〇 U /m l 青霉素+ l 〇〇 m g /m l 链霉素培养。

    注意：培养基移去后，不要再移动细胞，否 则 p H 将改变，转染效率将变低。

    磷酸钙转染
    (1) 在 15m l 的聚酯管中混合下列溶液， 2〇 nl的转移载体(1〇呢)， I5jil的包装质粒载 体(7.5邶)， IOfJ的 V S V g 包膜质粒载体(5|ug)，加 130叫 的 2mol/L CaCl2用水补充至ImI 体积。 (2) 在试管中将D N A +CaCl2+H 20 混 匀 ，并尽可能快地注入I m l 的 H E P E S 溶液中， 通过移液器上下混合5 次 ，静 置 lmin。 (3) 将 D N A +CaCl2 +H2O HEPES混合液加入到培养基中，并轻微摇晃，加入终浓度 1 % 的氯喹，然后把培养瓶放入培养箱中。 注意：应尽量减少细胞在培养箱外的操作时间，预 防 p H 的变化，以免减少转染效率。 (4) 加入转染试剂后3.5〜 5h 弃去培养基，用预热的P B S 洗 2 次 ，换 IOml预热新鲜 含 1 0 % 的小牛血清的培养基。 注意：如果不用P B S 洗 ，一些沉淀可能留在瓶底，将阻碍细胞的生长。 (5) 然后放培养瓶到培养箱中，放 置 48~60h ，收集细胞上清。

    病毒浓缩
    (1)转 染 48〜 60h 后 ，准备收集上清。 ⑵ 用 100%乙醇清洗超离心管并烘干。收集细胞上清到50m l 的离心管中，2000r/min 离 心 5min，移去大量的细胞碎屑。 (3) 用 0_45^im的滤器过滤，将滤过的细胞上清放入到4 0 m l 的超离心管中，为防止 溢 出 用 Parafilm膜密封，在 代 、 25 OOOr/min，离 心 90min。 (4) 将病毒上清倒入装有IOml漂白剂的烧瓶。倒掉离心管的残余培养基,加入iooy 的 P B S 和 H a n k 缓冲液溶解。用 Parafiim 膜密封，在 代 中 溶 解 现 ，然后把病毒分装在 10叫的容器中，储存在- 7 0 ^ 的冰箱中。 . 3 8 0

    慢病毒滴度测定
    1) FUGW 滴度测定

    将梯度稀释的病毒液加入 293T 细胞中， 72 h 后置于荧光显微镜下观察 G FP 的表达情 况 ，计数发焚光细胞数目，根据病毒用量和稀释度计算滴度。
    2) FUXW、 FAXW 的滴度测定用 Southern 斑 点 杂 交 方 法 确 定 FUXW、 FAXW 病 毒 滴 度 。
    ⑴ 重 组 慢 病 毒 感 染 细 胞 DNA抽 提 ：细 胞 B H K 以 IxlO6接 种 于 15c m 培养皿，在 3 7 ¾ 、5 % CO2条件下培养24h 后 ，换以新鲜培养液，加 入 Polybrene使其终浓度为8|ig/ml。 轻轻混匀后，加 入 20m l的重组慢病毒病毒上清(0.45p m 微孔滤膜)，继 续 培 养 24h 后 ， 换以新鲜培养液，培 养 72h 后 ，用胰酶消化细胞， 50〇 r/min离 心 5m in培养细胞，弃上清， 用 预 冷 的 PB S洗 2 次 ，用等体积的消化缓冲液悬浮细胞。将样品在盖紧的管中于5〇t 摇 荡 下 温 育 12〜 15h。 等体积的酸/氯仿/异戊醇抽提样品， 1700r/min离 心 IOmin, 将上层 水溶液转移至新管中。加 入 1.2体 积 7.5mol/L乙酸铵和2 倍体积的无水乙醇， 1700r/min 离 心 2min后 用 7 0 % 乙醇洗涤，晾干，沉 淀 用 T E 重新溶解，使终浓度在lmg/ml左右。 (2) 点膜：提取重组慢病毒感染细胞的DNA后作系列稀释，点在尼龙膜上。 阳性对 照 质 粒 pCMV-hFIX按 照 60ng、 6ng、 600pg、 60pg、 6p g 的梯度点在尼龙膜上。 (3) 固定：尼龙膜在2xSSC洗 过 ， 120尤、 30min。 ⑷ 探 针 制 备 :pC M V -hF IX 质粒经招 nd I I I 限制酶酶切后，回 收 1 .5 k b片段，取 1咫 加 水 到 16W 煮 沸 IO m in ,冰浴迅速冷却，加 4 叫D IG -highprim e ， 混 匀 ，离 心 ， 3 7 ^ ：、 20h 。 ⑶ 杂 交 ：膜 在 DIG Easy hyb杂 交 液 4 0 1 振荡(封袋)，预 杂 交 30min(10ml/100cm2) 后倒掉杂交液。探针煮沸5min变性后冰浴迅速冷却，加入杂交液中(25ng/ml DIG Easy hyb 液)，将探针-杂交液混合液加入封膜的透明袋中(3.5ml/100cm2 杂交液)，封 袋 4 0 ¾ 振荡 16h0 (6) 洗膜。 2xSSC， 0.1% SDS 2x5min， 1 5 ~ 2 5 ^ ; 0.5xSSC， 0.1% SDS 2x5min， 65¾ 〇 (7) 倒掉最后的洗膜液，在室温下用2xSSC漂洗膜，并吸干多余的液体，用塑料膜 包裹后放射自显影。

    慢病毒载体的离体感染

    rAAV 总 的 生 产 策 略

    材 料 和 试 剂

    1) H E K 293
    是贴壁依赖型成上皮细胞，含 有 A d 5 E l 区的人胚肾细胞，生长培养基为 D M E M (含1 0 % F B S )。 为腺相关病毒的包装细胞。

    2) A A V 载体包装系统
    包 括 p A A V - M S C (含有外源基因韵多克隆位点，用于插入目的基因)、辅助质粒 (如A d 8)、 腺病毒辅助基因或辅助病毒 (如 A d 5 ) 和包装细胞 (如 H E K 2 9 3 )。

    3) A A V Helper Free 包装系统
    包 括 p A A V - M S C 、 p H e l p e r 质粒和包装细胞 (如 H E K 2 9 3 ) 。 p H d p e r 质粒可直接提供
    互补基因和辅助基因。它包含有必需的腺病毒基因 V A E 4 E 2 A 和 r A A V 的包装基因 (哪、cap)，因此不需要腺病毒提供辅助基因，包 装 r V V 病毒颗粒时，只需将重组 A V V 载体与该质粒共转染到含有 E l 的 2 9 3 细胞即可，这样就避免了野生型 A d 的污染。

    4) OptiprepTM 分离液 (A XIS -S H IELD)
    主要成分是碘克沙醇 (Iodixanol)， 是一种高亲水性非离子的物质，这种主要成分决定了 O p t i p r e p T M 分离液是一种高密度、低黏度的溶液。而且，它的密度和渗透性成线形关 系 ，在加入适当浓度的缓冲液或基本培养基，如蔗糖、H E P E S 或 P R M I 后 ，O p t i p r e p T M能形成连续的或不连续的等渗的密度梯度溶液，可将各种细胞、细胞器、脂蛋白分离开经科研和临床实验证明，OptiprepTM 和常规的分离液 Ficoll、Percoll、蔗 糖 及 C sC l 相 比 ，OptiprepTM 分离液不仅分离纯化效果好，而且对各种细胞、细胞器的生命活性无任何影响。产品技术参数为 Iodixanol: 60% (m /V ); 密 度 :y(1.320±0.001)g/ml; 渗 透 压 ：(170±15)mOsmo

    实 验 方 法

    重 组 rAAV 病毒的包装






     


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    来源：丁香实验

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