IPG IEF pH 梯度的选择

对一新样品，常最先使用宽范围、线性PH3.5-10梯度 但对大多数样品，这样做会丧失 pH4-7 区域的分辦率，许多蛋白质的 pI 值在该区域。利用非线性 pH3.5-10 IPG IEF 胶在一定程度缓解这个问题。 PH3.5-10 非线性胶条在 pH4-7 区域的梯度要比 pH7-10 更为平坦，保证大部分碱性蛋白质都能得到分离的前提下， pH4-7 区域得到更好的分离（图 3.2) 但用 pH4-7 的 IPG IEF 胶则能在该范围得到更好的分离效果（图 J,J) 这些 pH 范围的胶条目前已经商品化, 实验室自制 pH4-9 的 IPG 胶也能覆盖来自许多不同种类样品的大多数蛋白质。这些梯度的 IPG 胶与加样杯上杆或胶内泡胀兼容，仕 Muhipho, 和 IPG phor系统都工作良好 均适用于分析胶（上样量 50-100μg) 或微量制备胶（上样量至 1mg ）典型运行条件如表 3.1 和 3.2 所示。

当分析真核细胞提取物一类复杂的样品时，由于空间分辨率所限，而且高丰度蛋白质存在时低拷贝数蛋白质显色困难，使得单一宽范围 pH 梯度 IFF 只能显示该细胞提取物全蛋白质组的一小部分。可以克服真核及组织蛋白质表达高动态范围和多样性问题的一种方法是进行样品前期分级（见 4.4) 。 另外一种有效的方案是利用复合重叠窄范围IPG 凝胶，跨度在 1-1.5pH 单位，该方法被称为“放大胶" (zoom gel)、复合胶或亚蛋白质组学 ( subproteomics)。 此外，也可用 24cm 的宽胶条。 pH4-7 之间的窄范围胶可用胶内泡胀或加样杯上样，在 Multiphor 或 IPGphor 仪器上运行（图 3.4) 。 这些凝胶是用于毫克上样量微量制备的理想选择，但制备胶需要加长聚焦时间，见表 3.1 和表 3.2) 。强碱性蛋白质如核糖体和核蛋白的 PI 值在 10.5 到 11.8 之间，可以用 pHl0-12 或pH9-12 窄范围 IPG (图 3 . 5) 分离，要获得高重复性的 2-DE 图谱，必须对 pH 梯度生成和凝胶组成进行不同的优化，如用 N, N'-二甲基丙烯酰胺取代丙烯酰胺，并在 IPG 泡胀液中加入异丙醇，从而抑制容易导致大量胶上条纹的反向电渗流 。 必须要用加样杯在阴极上样，且 IEF 要在硅油下进行 。从基因组序列计算获得的理论 2-DE 图谱显示全细胞裂解所获得的大部分蛋白质等电点在 pH4-9, 但同时相当一部分蛋白质等电点可以达到pH12。在经典 2-DE 中这些蛋白质只能用 NEPHGE 分离（见 3)' 但用 IPG IEF 很容易将这些蛋白质分开 。

具体作法是用上文所提到的窄范围 pHl0-12 或 pH9-12 的 IPG,但为了要获得某个细胞或组织蛋白质组的全貌，要先制备覆盖 pH3-12 和 pH4-12 的宽范围 IPG。 目前已获得细胞和组织提取及 TCA/丙酮沉淀蛋白质时通常在裂解缓冲液提取中缺失的 PI 值大于 10 的碱性蛋白质以及肺支原体中不溶于 Triton X-100 的细胞成分的良好的 2-DE 图谱。此外，在 pH9 和 pH12 间含一个平缓区的 pH4-12 IPG 可以对如核糖体蛋白质类强碱性蛋白质获得极好分离。 这些宽梯度可以在不含异丙醇的标准条件下运行，因为此时超过 pH10 的窄 IPG 胶中水合离子向阴极的强烈转移（反向电渗）特性可以忽略不计。此外，高分子质量蛋白质的渗入和聚焦也得到了明显改善（图 3.6) 。利用经典 O'Farrell 系统可以在宽分离距离（每个方向上超过 30cm) 上获得复杂蛋白质谱的最大分辨率。但是，若用 IEF 管胶技术，其成功则伴随着凝胶操作和处理过程中方便性的丧失。与此对比，在塑料支持膜上聚合的长 IPG 胶的处理不需要特殊注意之处 。 如覆盖 pH3-12 和 pH4-12 范围的 24cm IPG 胶条已成功使用（图 3 .6) 。此外，利用窄范围 pH 值（如 pH5 - 6) 的 24cm 长 IPG胶条可以获得高分辨 2-DE 图谱（图 3.7) 。