一维固相 pH 梯度等电聚焦(IEF with IPG)

实验分类：

蛋白质实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

来源：《蛋白质组学：从序列到功能》

来源：丁香实验

操作方法

基本方案

将所需 pH 范围的 IPG 平板胶在 GelBond PAGfilm (图3. lb) 上聚合，之后，凝胶用去离子水全面冲洗 (6X 10min), 浸人在 2% (m/V) 甘油中 (30min), 常温下在洁净橱中干燥，然后用塑料膜覆盖，如果凝胶不立即使用，可在-20℃ 贮存一年。用前，用切纸机从 IPG 平板胶切下所需数目的干胶条（图 3.lc) 。此外，各种 pH范围商品化的预制 IPG

胶条处理

用于2-DE 时，胶条应该散于重泡胀池（图 3, ld) 中在含 5mol/L 尿素的溶液（或2mol/L 硫脲和 5mol/L 尿素）中泡胀。溶液其成分为 0,5% 到 4% 非离子（NP-40,Triton X-100) 或两性 (CHAPS) 去污剂、 15mmol/LDTT 和 0.5% 适宜范围的 pH 值的SCA。然后将胶条直接放在水平平板电泳装钮的冷却板装面 (图 3.lg) 。另外

加样

样品通常是加在放置在 IPG 胶阳极区或阴极区的硅橡胶框内或特殊加样杯内（图3. lg, h), 对不同类型的样品，最好的加样位置由经验值确定。最初电压卫限制在150V 、 30min, 从而使尽队多的样品进入加样杯，然后逐渐增加电压至3500 V 。运行时间决定了几个不同的因素，包括样品类型、蛋白上样量、 IPG 胶条长度及所用 pH 梯度因为温度低时尿素可能会结晶，IEF 应当在 20℃运行

IPG IEF pH 梯度的选择

对一新样品，常最先使用宽范围、线性PH3.5-10梯度但对大多数样品，这样做会丧失 pH4-7 区域的分辦率，许多蛋白质的 pI 值在该区域。利用非线性 pH3.5-10 IPG IEF 胶在一定程度缓解这个问题。 PH3.5-10 非线性胶条在 pH4-7 区域的梯度要比 pH7-10 更为平坦，保证大部分碱性蛋白质都能得到分离的前提下， pH4-7 区域得到更好的分离（图 3.2) 但用 p

聚焦时间的优化

理论上讲，要获得最好的图谱质量和重复性所需最佳时间是 IEF 分离达到稳定态所需的时间。若聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹，但要避免过度聚焦。虽然与经典 O'Farrell 法相比，不会导致蛋白质向阴极的迁移（阴极漂移），但却会因为活性水转运而导致过多水在 IPG 胶表面渗出（电渗），会造成蛋白图谱变形。在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白质丢失。最佳聚焦时间必须根据不同蛋白质样品、蛋