固相pH梯度

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实验目的：分离蛋白质混合物，将样品进行电泳后，为了不同目的在它的直角方向再进行一次电泳。常说的双向电泳是根据蛋白质所带的电荷和分子 大小对蛋白质混合物进行分离。

实验原理：第一向等电聚焦的基本原理是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。第二向运用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据分子量大小对蛋白质进行分离。

基本过程：等电聚焦、平衡及转移到二向、SDS-PAGE

试剂或储液：IPG buffer、矿物油、DTT、碘代乙酰胺、过硫酸铵、TEMED、1M DTT、rehydration buffer、平衡液储液、30%丙烯酰胺单体储液、1.5M Tris-HCl、10% SDS、10X Tris-甘氨酸系统的电泳缓冲液、0.5%琼脂 糖、水饱和正丁醇、占位液

实验操作程序：

等点聚焦部分

1．根据选用的胶条的长度计算上样体积（见附1），加1M DTT到终浓度50mM需要的体积，补加IPG buffer到终浓度0.2%或者0.5%的体积，加rehydration buffer到该胶条的上样体积。

2．把各种溶液按计算的体积加入到eppendorf 管中，充分混匀，（或者超声5-10min）14000rpm,10℃离心5min。

3．取出胶条室温放置10min，平衡胶条的温度。

4．沿着聚焦盘中槽的边缘从左至右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则影响到胶条中蛋白质的分布。

5．当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。

6．分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+，安玛西亚胶条为尖端）对应于聚焦盘的正极（安玛西亚为尖端）。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。

7．在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发析出尿素。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

8．对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序（见附2）。

9．聚焦结束的胶条立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条吸干矿物油置于平衡管中，-80℃冰箱保存。

注意事项：

参见“双向电泳培训班讲义（定稿）”中等电聚焦注意事项部分。

附1：

胶条长度、上样量、上样体积、等点聚焦的伏小时数的设置及说明

胶条长度

7cm

11cm

13cm

17cm

18cm

24cm

上样体积

125ul

185ul

250ul

300ul

350ul

450ul

银染上样量范围 pH3-10L (ug)

5-100

15-200

25-250

30-300

40-400

50-500

推荐使用量（ug）

50

100

125

150

200

250

银染VHrs

12000

20000

24000

30000

36000

52000

考染上样量范围 pH3-10L (mg)

0.05-0.5

0.15-1.2

0.25-1.5

0.25-2.5

0.75-3

1-4

推荐使用量（ug）

250

500

650

750

1000

1250

考染VHrs

22000

30000

34000

40000

46000

62000

说明：
1．pH3-10NL, pH4-7, pH6-11的上样量与pH 3-10相比增加1.5-2倍，聚焦伏小时数延长约10000VHr
2．按照推荐量上预实验，根据预实验结果调整上样量，样品中蛋白质分布均匀按推荐量使用，如果有高丰度的蛋白质适当降低上样量，如果显得少则适当加大上样量。聚焦的伏小时数可以根据聚焦的情况进行调整。