病毒——基因治疗中有效的载体系统

肖英华　李雅轩　郑继刚(首都师范大学 生物 系北京100037)

摘要　基因治疗面临的首要问题是如何选择适当的基因载体将具有治疗价值的基因导入靶细胞并使其有效表达, 以达到治疗疾病的目的。目前基因治疗临床试验中采用的载体大多数为病毒载体。本文主要介绍基因治疗中常用的4 种病毒载体的 生物 学特性, 以及各个载体在基因治疗中的优缺点。

关键词　基因治疗　病毒载体

在基因治疗中, 病毒已成为一种有效的载体系统。基因治疗就是将外源基因导入目的细胞并使其有效表达, 从而达到治疗疾病的目的。作为当代医学和生物学的一个新的研究领域的基因治疗始于20 世纪80 年代。直到1990 年美国成功地应用基因治疗手段对 ADA (腺苷脱氨酶) 缺陷病进行治疗, 才标志着基因治疗时代的开始。目前, 基因治疗已从遗传病扩展到非遗传病领域, 例如: 传染病, 肿瘤, 神经系统疾病, 免疫缺陷病等。

有效的基因治疗依赖于外源基因在目的细胞中高效、稳定的表达, 而这在很大程度上取决于基因治疗采用的载体系统。目前基因治疗中所用的载体可分为两大类: 病毒载体和非病毒载体。其中应用最广泛的是病毒载体, 约85% 的基因治疗临床项目采用的均是这种载体, 因其充分利用了病毒高度进化所具有的感染和寄生特性。从理论上讲, 各种类型的病毒都可改成为载体, 但是由于人们对许多病毒的生活周期, 分子生物学认识不够, 所以现在只有少数病毒能够改造成为基因治疗所需要的载体。其中反转录病毒, 腺病毒, 腺相关病毒, 单纯疱疹病毒是基因治疗中最常用的4 种病毒载体。

1　反转录病毒载体

反转录病毒是一种RNA 病毒, 基因组大小在8～ 11kb 之间。反转录病毒经寄主细胞表面的受体蛋白识别后进入细胞, 然后在自身基因组编码的 反转录酶 的作用下, 以基因组RNA 为模板反转录出双链DNA。双链DNA 能够随机整合到寄主细胞的染色体上, 随着寄主细胞的复制而复制。

从W ei 等(1981 年) 构建第1 个反转录病毒载体以来, 已相继构建了一系列的载体。尤其在1990 年美国成功应用反转录病毒载体进行ADA 患儿的基因治疗以来, 反转录病毒载体的研究和应用受到了极大的重视。目前临床上运用最多是反转录病毒载体。这种病毒载体大多基于禽类或兽类病毒, 现在主要以小鼠白血病病毒(一种肿瘤反转录病毒) 为基本骨架构建反转录病毒载体, 这种基因载体具有以下优点: 1) 宿主细胞广泛, 能够感染不同生物种类的多种类型细胞; 2) 能高效的感染分裂细胞, 感染率高达100%; 3) 能使外源基因完全整合到宿主细胞染色体上。但也有明显的不足, 主要表现在以下几个方面: 1) 不能感染非分裂的细胞; 2) 可能产生具有复制能力的病毒; 3) 由于是随机整合, 可能会引起“插入诱变”; 4) 包装外源DNA 能力有限, 小于8 kb; 5) 要求靶细胞表面要具有反转录病毒的相应受体。 （生物秀实验频道 www.bbioo.com）

慢病毒载体的研究和应用是近几年来反转录病毒载体研究领域的最新研究进展。慢病毒属于反转录病毒的1 个亚类, 包括各种灵长类病毒(如, H IV 21, H IV 2 22人类免疫缺陷病毒, S IV 2猴免疫缺陷病毒) 和非灵长类病毒(如,MVV 2羊进行性间质肺炎病毒, F IV 2猫免疫缺陷病毒, E IAV 2马传染性贫血病毒)。与肿瘤反转录病毒相比, 慢病毒有着复杂的基因组, 因其基因组中存在核定位信号序列, 它能够有效感染并整合到非分裂细胞和最终分化的细胞(除G0 期) , 例如: 神经细胞, 巨噬细胞, 肝细胞, 心肌细胞。这些不同类型的细胞作为基因治疗的靶细胞在临床上具有重要价值。慢病毒载体中开发较早研究较多的是以H IV 21 为基础构建的载体。

2　腺病毒载体

腺病毒为线性双链的DNA 病毒, 基因组为30～ 36 kb。腺病毒与宿主细胞细胞膜上的特异受体结合经内吞作用进入细胞, 其外壳在内粒中降解, 其病毒 DNA 则进入细胞核。在细胞核中腺病毒并不整合到宿主细胞染色体上, 而是以染色体外成分存在。腺病毒对上皮细胞, 角膜和消化道上皮细胞具有一种天然的嗜向性。腺病毒在自然界分布广泛, 在许多哺乳动物和禽类中都发现有存在。自1953 年第一次分离到腺病毒以后, 至今已分离到100 种以上不同 血清 型的各种腺病毒, 其中人的腺病毒有50 种以上。与临床疾病相关的腺病毒通常较温和, 很少危及生命。

腺病毒载体首次运用到临床, 进行的是囊性纤维化病的治疗, 即利用腺病毒载体转移囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR) 基因到患者体内, 使其在呼吸道上皮细胞内得以表达。至今在临床试验中运用的腺病毒载体主要为第一代腺病毒载体, 治疗的疾病包括肿瘤、遗传病、心血管病等。以腺病毒为基础构建基因转移载体具有以下优点: 1) 人类是腺病毒的天然宿主, 所以比较安全; 2) 该病毒在体外稳定, 易于制备与纯化; 3) 宿主范围广, 既可感染分裂细胞, 又可感染非分裂细胞; 4) 可原位感染, 特别是肺, 可经口服, 喷雾, 气管内滴注等途径进行治疗; 5) 外源基因表达水平较高。不足之处在于: 1) 它几乎可以感染所有的细胞, 因此缺乏特异性; 2) 因不能整合到宿主染色体上, 所以不能持续表达所需产物, 表达时间短暂, 需重复给予载体制剂治疗; 3) 因可能刺激免疫反应, 使反复治疗的效果会逐渐降低。（生物秀实验频道 www.bbioo.com）