基因治疗--BIA Separations！让病毒纯化更高效

基因治疗是目前生物医药领域热门的话题之一，生物医药行业对基因治疗持续高涨的热情，令该领域许多公司开始将一次治愈性基因疗法，作为其开发的战略核心。
   有行业报告显示，未来预计 6 年内，将有多达 60 种基因疗法获得批准，这些基因疗法在 2024 年的销售额将达到 146 亿美元。
   基因治疗的核心是基因载体，病毒载体占据着绝对主导地位。目前腺相关病毒（AAV）和慢病毒（LV）是临床上广泛使用的病毒载体。

   从 2012 年荷兰 UniQure 公司的，世界上 A AV 基因治疗药物 Glybera 在欧盟获上市，到 2016 年 GSK 与意大利 San Raffaele  合作开发的 LV 基因治疗药物 Strimvelis 再次在欧盟获批，再到 2017 年诺华获得 FDA 肿瘤药物咨询委员会以 10:0 的投票结果，一致批准的自体回输 CAR-T 细胞疗，及同年 Spark Therapeutics 公司获 FDA 批准的一个传疾病的基因治疗药物 Luxturna，AAV 和 LV 越来越成为基因治疗的主角。AAV 和 LV 大都采用质粒瞬时转染方法生产，从而高质量、高纯度的质粒是制 AAV、LV 等病毒载体的前提条件。

  质粒是常见的分子生物学工具，是一段 DNA 双螺旋结构。而抽提质粒几乎是分子生物学基础实验之一。

  科研水平的实验，通常的质粒抽提试剂盒就足以满足微克至数毫克级的需求，但是如果需要大规模制备病毒载体，试剂盒的质粒产量就非常的力不从心了。
  此外，包装病毒通常需要三个质粒或四个质粒，每个质粒大小、序列都不一样，上游表达量也有区别，甚至稳定性都有差异。

   面对如此众多品种的质粒，有没有一种质粒 DNA 纯化平台，能够适用多种质粒的、可放大的，满足基因治疗、细胞治疗和疫苗的高纯度和同质性的标准要求，并且还需要有效，稳健和可扩展的下游过程呢?

 

   接下来为大家隆重介绍 BIA Separations 提供的，基于对流相互作用介质（CIM）层析整体柱的两步质粒 DNA（pDNA）纯化平台！
   该方法除了具有以上全部优点，并且可以明显降低纯化时间，提高生产效率，使其成为 GMP 环境下的大规模 pDNA 纯化的选择。
   该方法专为纯化大分子和纳米颗粒的整体柱而设计，可实现快速操作，高流量，同时提供动态结合能力和分辨率。

 

首先要为整个过程中的核心——两步层析步骤，准备细菌培养液
 

1. 大肠杆菌收获、裂解－碱裂解：
 

这是快速高效纯化质粒 DNA 亚型的基础。
 

操作建议：
 

  先收集菌体；
  然后采用碱性裂解法制备原料；

  再将细菌细胞（通常是细胞生物质或细胞沉淀）悬浮在 50 mMTris-HCl，10 mM EDTA，pH8.0 中；

  通过加入等体积的 0.1-0.4M NaOH，1%SDS 进行裂解。

2. 裂解液浓缩：
 

氯化钙沉淀后澄清，除去了大量的主要样品杂质

  裂解后，悬浮液变粘稠，通过加入与悬浮缓冲液等体积的，4-8℃ 冷却的 3M CH 3 COOK（pH 5.5）沉淀细胞碎片和 SDS 复合物。

  在温和混合下，缓慢加入 CaCl2 并孵育 15 分钟。

TIPS:
 

1. 氯化钙用作沉淀剂，以去除 RNA、基因组 DNA 和其他杂质;

2. 较高浓度的杂质需要 CaCl2 浓度高达 1M;

3. 考虑测试多种浓度并评估产品中杂质的有效去除和未受影响的 pDNA 产量;

4. 加入速度应该很慢，以防止局部温度上升;

5. 孵育后，进行一系列澄清步骤，从离心或粗过滤开始，例如 80μm 深度过滤，并以 1-5μm 过滤结束。

（低温有利于沉淀，混合过程应该温和操作，以防止 DNA 降解。）

 

 

前面 blabla 说了那么多，然而纯化才是本工艺的精华所在。
 

BIA Separations 的二步纯化工艺的稳健性、连贯性、时效性，均堪称教科书式的经典。
 

首先纯化的柱子，通过弱阴离子交换，浓缩 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA；
 

第二步利用疏水相互作用色谱（HIC）的抛光步骤，进一步从超螺旋（SC）治疗级 pDNA 中除去开环（OC）和线性 pDNA 亚型。
 

两步纯化的作用功能明确、互相合作，大大节省操作步骤和时间。

 

​​​​​​​   AEX 色谱柱（CIMmultus™DEAE）浓缩 pDNA，并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA。

​​​​​​​   在弱阴离子交换柱上捕获质粒 DNA，其中除去剩余的 RNA 和蛋白质，样品结合需要低电导率，通过稀释实现。 

​​​​​​​   随着增加 NaCl 的梯度洗脱，首先洗脱 RNA，然后洗脱质粒 DNA。

 

层析条件
 

Monolithic column:	CIMmultus™  DEAE(2 µm~undefined1
phase:	Equilibration  buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA,   pH 7.2
	Washing buffer  A2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.6 M   NaCl, pH 7.2
	Elution buffer  A3: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 M   NaCl, pH 7.2
Working flow rates:	0.5 – 5 column volume (CV) /min (具体取决于样品特性，使用的层析设备和色谱柱尺寸)

 

层析方法
 

1.  用去离子水稀释细菌裂解物至电导率为 35-40mS / cm。稀释取决于样品制备过程中添加的 CaCl2 浓度。

2.  将稀释的样品用 0.45μm 过滤器进行过滤。

3.  将 20CV 的缓冲液 A1 平衡 DEAE 柱。

4.  将澄清的稀释细菌裂解液进行上样。

5.  用 20 CV 的缓冲液 A1 对色谱柱进行流洗。

6.  用 20 CV 的缓冲液 A2 对色谱柱进行流洗。

7.  用 20 CV 的缓冲液 A3（以半工作流速）洗脱并收集 pDNA。

图 1：AEX CIMmultus™DEAE（2μm）柱上的质粒 DNA 洗脱曲线

 

​​​​​​​    在高配体密度丁基修饰的（CIMmultus TM C4 HLD）整体柱上，利用疏水相互作用色谱柱（HIC）的抛光步骤，进一步从        超螺旋（SC）治疗级 pDNA 中除去开环（OC）和线性 pDNA 亚型。

​​​​​​​ ​​​​​​​   为了富集质粒 DNA 的超螺旋亚型，将 DEAE 洗脱液上样到高配体密度丁基柱（C4 HLD）上。 

​​​​​​​ ​​​​​​​   该步骤进一步去除了杂质。

 

层析条件

 

phase:	Equilibration  buffer B0:   50 mM Tris, 10 mM EDTA, 3 M   (NH4)2SO4, pH 7.2
	Washing  buffer  B1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1.7  M (NH4)2SO4, pH 7.2
	Adjustment  buffer: 4 M (NH4)2SO4
	Elution  buffer  B2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.4  M (NH4)2SO4 , pH 7.2
	Regeneration  buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2
Working flow  rates:	0.5 – 5 CV/min (具体取决于样品特性、使用的层析设备和色谱柱尺寸)

 

层析方法

 

1.  调节来自 DEAE 柱的含 pDNA 洗脱液，每 1 体积（V）洗脱液加入 3 体积（V）的 4M(NH4)2SO4。

2.  用 20CV 的缓冲液 B0 来平衡 C4 HLD 柱。

3.  将 DEAE 柱洗脱的 pDNA 组份上样。

4.  用 20 CV 的缓冲液 B1 流洗色谱柱。

5.  用缓冲液 B2（以半工作流速）洗脱并收集 pDNA。

6.  用 30 CV 的缓冲液 A1 再生色谱柱。

7.  加样 3 次后，对柱子进行清洗。

图 2：在 HIC CIMmultus TM C4 HLD（2μm）柱上分离超螺旋质粒 DNA

 

·  从 C4 HLD 柱洗脱的超螺旋 pDNA 组份含有硫酸铵，必须在生物应用质粒之前将其除去。

·  缓冲液交换可通过透析滤过或体积排除色谱等方法进行。

·  配置和填充可能需要额外的处理。
 

二步法层析过程分析：

 

​​​​​​​    质粒 DNA 制造成功的关键是实时过程控制方法，确保最终产品中高百分比的超螺旋 pDNA。 

​​​​​​​​​​   CIMac™pDNA 分析柱可用于监测降解产物（开环和线性 pDNA），去除杂质（RNA），并确保每个生产步骤都能产生预期的超螺旋 pDNA 量。

​​​​​​​   ​​​​​​​CIMac™pDNA 分析柱还用于超螺旋质粒 DNA 含量的质量控制。

图 3：使用 CIMac™pDNA-0.3 分析柱的质粒 DNA 亚型含量的质量控制

 

结果和结论：
 

​​​​​​​ ​​​​​  通过优化裂解、沉淀和两种色谱步骤相结合，可生产满足所有监管要求的纯 pDNA。

​​​​​​​ ​​​​​​​  可以完成去除 99% 以上的主要杂质（RNA，基因组 DNA，宿主细胞蛋白，内毒素和开环 pDNA）。

​​​​​​​ ​​​​​​​  此外，快速（大肠杆菌的 pDNA 提取和纯化可在几小时内完成），可重复的过程可降低运营成本并提高工厂生产率。 

​​​​​​​ ​​​​​​​  独特的整体特性有助于该过程的直接可扩展性，涵盖从小规模实验室到大规模工业纯化 pDNA 的生产水平。

Table 1: Process results.

 

Process  yield	>  80 %
A260/280	1.92
Homogeneity  (SC pDNA)	>  97 %
HCD  – removed	>  99.5 %
HCP  - removed	>  99 %
Endotoxin	<  2 EU/mg pDNA
RNA  - removed	>  99 %

 

点评 
 

目前市面上有不少质粒纯化工艺方案，但是比较下来，BIA 二步法纯化工艺具有两大优势：
 

​​​​​​​  效率明显提高

只需两步色谱和高流速的整体柱色谱方案，减少工艺步骤（提高回收率）并加快纯化速度，从而显著提高生产率。
 

​​​​​​​   灵活放大

由于特定的整体柱设计，质粒 DNA 过程可以快速扩展到更大的单位。 

在 1 毫升色谱柱上设计的工艺可以轻松转移到试验和生产规模。

在 8L 色谱柱上单次运行可以产生 48 g 药物级 scDNA。
 

Table 2: Scale up options.

 

Column size	pDNA  purified per cycle
1  mL	6  mg
8  mL	48  mg
80  mL	480  mg
800  ml	4.8  g
8000  mL	48  g

 

十多年来，BIA Separations 一直是高效率质粒纯化的好选择。它不仅提供整体柱和平台模板，还提供定制的纯化服务，以完全满足您的质粒 DNA 纯化需求

159 0176 2218（VX同号）

 

 

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