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放射性碘标记:氯胺T法

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 氯胺T法标记效率高、重复性好、试剂便宜易得,是目前使用最多的碘标记方法。
   1 .原理氯氨 —T Chloramine--T )是一种温和的氧化剂,在水溶液中产生次氯酸,可使碘阴离子氧化 成碘分子。这活性碘可取代肽链上酪氨酸苯环上羟基位的一个或两个氢,使之成为含有放射性碘化酪氨酸的多肽链。


  2.方法以 125 I—AVP的制备为例。
  (1)碘化反应:AVP5μg+0.5mol/l PB50μl(pH7.5)+ 125 1800μCi,混合后,加入新配置的Ch—t 30μg/15μl(0.05mol/l PB, pH7.5)。迅速振荡混匀,室温下反应40s。
  (2)终止碘化反应:加入还原剂偏重亚硫酸钠40μg/20μl(0.05mol/l PB, pH7.5),以终止碘化反应。
  (3)Bio—Gel P 2 层析纯化:将碘化反应混合液注入Bio—Gel P 2 柱,用0.1n HAC溶液洗脱,分部收集,每2min收集一管,共收集60管。
  (4)放射性测量:测定各收集管的放射性,出现两个峰,第一峰为 125 I—AVP,第二峰为游离碘盐峰。第一个峰中计算最高的几管,留下备用。
  为了解标记抗原的质量,每次碘标记后应计算出碘的利用率,标记上多少放射性碘,以及每微克抗原结合上多少放射性碘。
  (5)标记抗原的贮存:经纯化与检查后的标记物、加入1/8体积的异丙醇,分成若干小份,置于铅罐中,在-20℃以下的冰箱中贮存备用,应避免反复冻融。标记抗原在贮存中是不稳定的,这是因为:一是脱碘,标记的碘从原来位置上脱落,变成游离碘;二是蛋白损伤、变性,成为聚合大分子或断键成小分子碎片。由于上述原因,使B/F明显降低,标准曲线斜率变小,以致不能使用,故需分离纯化,其方法是用Sephadex G100长柱(40~80cm )过柱,洗脱后出现3个峰。第1个峰分子量大,是蛋白变性的聚合的大分子,尚保留部分抗原决定簇,免疫活性弱;第2个峰是纯抗原的蛋白峰,免疫活性好;第3个峰是游离 125 I或小分子碎片,不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰,免疫活性好;第3个峰是游离 125 I或小分子碎片,不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰,其性能类似于新鲜标记的抗原。分离纯化的方法解决了标记抗原的贮存、长期使用问题,特别对来之不易的抗原更显得重要。
  2.注意事项 免疫学实验技术论坛   http://bbs.bbioo.com/forum-140-1.html
  (1)放射性碘源的选用:无载体的 131 I或 125 I均可用于碘化标记,但应尽量选用新鲜的、比放射强度高的、含还原剂量少的放射性碘源。碘源的比放射强度最好&ge;50~100mCi/ml,至少也要>30mCi/ml,否则加入碘源的容量要增加,随着带入碘源中含有的还原剂(为放射性碘源运输保存所需加入)量也增加,这将会显著降低碘利用率及标记蛋白比放射强度。放置较久和放射性碘源,一方面因衰变致比放射强度降低,另一方面因水的辐射化学产物增多(主要是 131 I源),都会降低标记时的碘利用率。放射性碘源含还原剂(如Na 2 S 2 O 5 等)量多时,会抵消氯胺T的作用,降低碘利用率,甚至导致标记完全失败。放射性碘源要用无载体的,标记所用全部用具和 试剂 必须不含碘;只要有极少量的碘的污染,非放射性碘就会稀释放射性碘,使放射性碘利用率显著降低。为了便于放射性防护和除污染,以及减少射线对蛋白质分子的损伤,标记投入的放射碘量不宜过大,一般以<5mCi为宜。
  (2)放射性碘与多肽、蛋白质用量的比例:这比例对标记结果的影响很大。如上述原因,一般标记时放射性投入量不宜过多,示踪实验室中常规每次只用1~2mCi,因而放射性碘与多肽、蛋白质用量的比值主要靠标记时投入的多肽、蛋白质用量来控制。当投入的放射碘量一定时,多肽、蛋白质用量多(即I/多肽、蛋白质比值低),能获得高碘利用率,但所得标记蛋白比放射强度低;相反多肽、蛋白质用量少(即I/多肽、蛋白质比值高),则碘利用率降低,但所得标记多肽、蛋白比放射性随此比值变化都有较大的变动;而当此比值<1后,则碘利用率再下降的幅率较小,标记多肽、蛋白比放射性也不会再增加多少。
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