放射性碘标记

第二节　放射性碘标记

在RIA中，标记抗原质量的优劣，直接影响测定结果，必须制备比放射性强、纯度高的标记抗原，并保持免疫活性不受丧失。

一、同位素的选择

　　同位素有稳定性和放射性两种。放射性同位素可利用其衰变时放出的放射线进行测量，这种测量较灵敏而方便，故多用放射性同位素。标记抗原，常用的放射性同位素有 ³ H、 ¹⁴ C、 ¹³¹ I和 ¹²⁵ I等。在使用上各有其优缺点，可根据所进行的放射免疫分析的类型特点，标记物制备和供应情况以及实验室设备条件等作适当的选择（表8-1）。大多数抗原分子中都含有C、H等原子，所以用 ¹⁴ C或 ³ H标记不改变抗原的结构及其免疫学活性，且 ¹⁴ C、 ³ H半衰期长，所标记的抗原长时间放置后仍可使用，这都是其优点。 ¹⁴ C或 ³ H标记的不足之处是操作较繁琐，并难以获得高比放射性的标记物； ³ H及 ¹⁴ C放出的都是弱β射线，需用较昂贵的液体闪烁计数器方能获得较高效率的测量，且测定操作也较麻烦。但某些抗原用放射性碘标记容易丧失免疫化学或生物学活性者，则仍以采用 ³ H或 ¹⁴ C标记物为佳。

表8-1 标记抗原常用的放射性同位素及其性质

放射性元素 半衰期 射线种类及能量（百万电子伏特） β γ

¹⁴ C 5720年 0.155 －

³ H 12.5年 0.0189 － ¹²⁵ I 60天 － 0．035

¹³¹ I 8.05天 0.608，0.335，0.250 0.364，0.637，0.722

大多数抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改变了抗原的分子结构，往往容易损伤抗原的免疫化学活性；且放射性碘的半衰期较短，标记物放置后因衰变使放射性降低，因而需要经常制备标记物或要求能定期提供放射性碘标记都能适用，放射性碘放出γ―射线，用一般晶体闪烁计数器就能获得较高效率而精确的测量，测量操作也很简单。由于这些突出的优点，目前在放射免疫分析中，使用放射性碘标记物最多。

　　从应用角度来看， ¹³¹ I和 ¹²⁵ I又各有其优缺点，可根据实验的要求、仪器的条件和放射性碘制剂的规格等条件合理选用。但相对而言， ¹²⁵ I有较多的优点，一是半衰期适中，允许标记化合物的商品化及贮存应用一段时间；二是它只发射28keV能量的X射线和35keV能量的γ射线，而无β粒子，因而辐射自分解少，标记化合物有足够的稳定性。放射性碘适用于放射免疫分析许多对象（包括蛋白质、肽类、固醇类、核酸类以及环型核苷酸衍生物等）的标记，且操作简单，一般实验室都不难做到。

二、蛋白质与多肽激素的放射性碘标记

要制备高比度、高纯度与免疫化学活性好的标记物，首先要有高纯度、良好免疫活性的抗原。用作放射标记加网免疫分析的特异性，所以若用纯度不高的抗原作标记，则标记后必须采取适当的步骤除去杂质，以获得高纯度的标记物。标记对象的纯化应尽量采用温和的方法，否则在纯化操作中已受潜在性损伤的蛋白质（这时表面上活性可能还是良好的），再经标记反应时所受的损伤，活性就会显著降低，影响以后的放射分析结果。有了好的纯抗原，还要采用适当方法加以标记，尽量获取高比放射性、而又能保持良好的特异免疫化学活性的标记物。这些都是放射免疫分析能取得高特异性和高灵敏度的关键问题。

　　多肽激素与蛋白质多用碘标记，最常用的是 ¹²⁵ I。碘化反应的基本过程如下：通过氧化剂的作用，使碘化物（ ¹²⁵ I ^- ）氧化成的碘分子（ ¹²⁵ I ₂ ），再与多肽激素、蛋白质分子中的酪氨酸残基发生碘化作用。所以不管采用哪一种放射性碘标记法，标记的化合物内部必须有碘原子可结合的基团，即结构上要含有酪胺基或组织胺残基。凡蛋白质、肽类等抗原，在结构上含有上述基团的可直接用放射性碘进行标记。如不含上述基团的，放射性碘无法标记，必须在这些化合物的结构上连接上述基团后才能进行碘标记。

因此影响蛋白质、多肽碘化效率的因素，主要决定于蛋白质、多肽分子中酪氨酸残基的数量及它们在分子结构中暴露的程度；此外，碘化物的用量、反应条件（pH、温度、反应时间等）及所用氧化剂的性质等也有影响。

常用的标记方法有：

（一）氯胺T法

　　氯胺T法标记效率高、重复性好、 试剂 便宜易得，是目前使用最多的碘标记方法。

1．原理氯氨―T（Chloramine--T）是一种温和的氧化剂，在水溶液中产生次氯酸，可使碘阴离子氧化成碘分子。这活性碘可取代肽链上酪氨酸苯环上羟基位的一个或两个氢，使之成为含有放射性碘化酪氨酸的多肽链。

　　2．方法以 ¹²⁵ I―AVP的制备为例。

　　（1）碘化反应：AVP5μg+0.5mol/l PB50μl（pH7.5）+ ¹²⁵ 1800μCi,混合后，加入新配置的Ch―t 30μg/15μl(0.05mol/l PB, pH7.5)。迅速振荡混匀，室温下反应40s。

（2）终止碘化反应：加入还原剂偏重亚硫酸钠40μg/20μl(0.05mol/l PB, pH7.5),以终止碘化反应。

　　（3）Bio―Gel P ₂ 层析纯化：将碘化反应混合液注入Bio―Gel P ₂ 柱，用0.1n HAC溶液洗脱，分部收集，每2min收集一管，共收集60管。

　　（4）放射性测量：测定各收集管的放射性，出现两个峰，第一峰为 ¹²⁵ I―AVP，第二峰为游离碘盐峰。第一个峰中计算最高的几管，留下备用。

为了解标记抗原的质量，每次碘标记后应计算出碘的利用率，标记上多少放射性碘，以及每微克抗原结合上多少放射性碘。

　　（5）标记抗原的贮存：经纯化与检查后的标记物、加入1/8体积的异丙醇，分成若干小份，置于铅罐中，在-20℃以下的冰箱中贮存备用，应避免反复冻融。标记抗原在贮存中是不稳定的，这是因为：一是脱碘，标记的碘从原来位置上脱落，变成游离碘；二是蛋白损伤、变性，成为聚合大分子或断键成小分子碎片。由于上述原因，使B/F明显降低，标准曲线斜率变小，以致不能使用，故需分离纯化，其方法是用Sephadex G100长柱（40～80cm ）过柱，洗脱后出现3个峰。第1个峰分子量大，是蛋白变性的聚合的大分子，尚保留部分抗原决定簇，免疫活性弱；第2个峰是纯抗原的蛋白峰，免疫活性好；第3个峰是游离 ¹²⁵ I或小分子碎片，不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰，免疫活性好；第3个峰是游离 ¹²⁵ I或小分子碎片，不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰，其性能类似于新鲜标记的抗原。分离纯化的方法解决了标记抗原的贮存、长期使用问题，特别对来之不易的抗原更显得重要。

2．注意事项

　　（1）放射性碘源的选用：无 载体 的 ¹³¹ I或 ¹²⁵ I均可用于碘化标记，但应尽量选用新鲜的、比放射强度高的、含还原剂量少的放射性碘源。碘源的比放射强度最好≥50～100mCi/ml，至少也要>30mCi/ml，否则加入碘源的容量要增加，随着带入碘源中含有的还原剂（为放射性碘源运输保存所需加入）量也增加，这将会显著降低碘利用率及标记蛋白比放射强度。放置较久和放射性碘源，一方面因衰变致比放射强度降低，另一方面因水的辐射化学产物增多（主要是 ¹³¹ I源），都会降低标记时的碘利用率。放射性碘源含还原剂（如Na ₂ S ₂ O ₅ 等）量多时，会抵消氯胺T的作用，降低碘利用率，甚至导致标记完全失败。放射性碘源要用无 载体 的，标记所用全部用具和试剂必须不含碘；只要有极少量的碘的污染，非放射性碘就会稀释放射性碘，使放射性碘利用率显著降低。为了便于放射性防护和除污染，以及减少射线对蛋白质分子的损伤，标记投入的放射碘量不宜过大，一般以<5mCi为宜。

（2）放射性碘与多肽、蛋白质用量的比例：这比例对标记结果的影响很大。如上述原因，一般标记时放射性投入量不宜过多，示踪实验室中常规每次只用1～2mCi，因而放射性碘与多肽、蛋白质用量的比值主要靠标记时投入的多肽、蛋白质用量来控制。当投入的放射碘量一定时，