蛋白质SDS-PAGE电泳与蛋白质印迹免疫分析（Western Blot）

一、蛋白质SDS-PAGE电泳

1、安装垂直板电泳装置

用洗洁精、清水和无水乙醇清洗两块玻璃板，晾干后安装。

2、制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶

（1）配制9%分离胶（15ml）：双蒸水6.55ml，1.5M Tris-HCl（pH8.8）3.75ml，30%丙烯酰胺储存液（Acry/Bis）4.5ml，10%SDS 150ml，10%过硫酸铵（APS）50ml，混匀后加入3.75ml TEMED，立即混匀，灌入装好的垂直板中，至距离短玻璃顶端约2cm处。检查是否有气泡，如果有，用滤纸条吸出。在胶液上面加一层双蒸水，静置，待凝胶与水的界面清晰时，说明分离胶已聚合（约30分钟），去除水相，用滤纸吸干残存的液体。

（2）配制4%浓缩胶（10ml）：双蒸水6.1ml，0.5M Tris-HCl（pH6.8）2.5ml，30%丙烯酰胺储存液（Acry/Bis）1.3ml，10%SDS 100ml，10%过硫酸铵（APS）50ml，混匀后加入10ml TEMED，立即混匀，灌入垂直板中至短玻璃顶端，插入梳子，避免产生气泡，静置，约60分钟后，胶聚合，拔去梳子，用电极缓冲液冲洗加样孔，以去除未聚合的丙烯酰胺。

（3）将凝胶固定在电泳槽中，上下槽各加入1´Tris-甘氨酸电泳缓冲液，驱除两玻璃板间凝胶底部的气泡。

3、样品处理及上样
在Ependorf管中加入蛋白提取液16ml，5×上样缓冲液4ml，充分混匀，与蛋白分子量标准一起放在100°C沸水中煮5分钟后，用微量加样器上样。为了便于比较蛋白电泳结果和免疫印迹结果，采取对称加样。

4、电泳
将电泳装置接通电源。开始电泳时，电压为80V，当样品进入分离胶后，将电压调到150V。继续电泳至样品前沿抵达分离胶底部，断开电源。

二、蛋白质印迹免疫分析（Western Blot）

1、蛋白质转膜

（1）取下胶板，小心去除一侧玻璃板，切去浓缩胶和分离胶无样品的部分，将凝胶分成两半，含分子量标准的部分用考马斯亮蓝染色。

（2）精确测量剩余胶的大小，按该尺寸剪取一张硝酸纤维素膜和两张滤纸（BioRad专用），在转移缓冲液中将膜和滤纸浸泡15分钟。

（3）海绵在转移缓冲液中充分浸湿。

（4）用于转膜的凝胶放在转移缓冲液中洗涤。

（5）打开蛋白质转移槽夹板，按下列顺序依次安放：
a.浸湿的海绵
b.用转移缓冲液饱和的滤纸
c.凝胶
d.硝酸纤维素膜
e.用转移缓冲液饱和的滤纸
f.浸湿的海绵
在每放一层的时候，都要冲加转移缓冲液，小心地赶走每层之间的气泡。

（6）小心合上夹板，放入转移槽中，倒入转移缓冲液，加冰块。

（7）插入电极，注意正负极的方向，将电泳仪调至150mA，转移2小时。

2、封闭 ：将转移后的硝酸纤维素膜放在TBS缓冲液中，漂洗5分钟，然后膜的正面朝上，放在装有封闭液的平皿中，室温轻摇30分钟。

3、一抗结合将硝酸纤维素膜放入杂交袋中，封好三面，按0.1ml/cm2加入封闭液和小鼠抗人p53蛋白的单克隆抗体（1:400稀释），驱赶气泡，封严杂交袋，膜的正面朝上，放在摇床上，4°C轻摇过夜。

4、二抗结合
剪开杂交袋，取出硝酸纤维素膜，用TTBS漂洗3次，每次5分钟。再将膜放入杂交袋，封好三面，按0.1ml/cm2加入封闭液和碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠IgG（1:500稀释），驱赶气泡，封严杂交袋，膜的正面朝上，放在摇床上，室温下轻摇2小时。

5、显色反应

取出膜，用TTBS漂洗3次，每次5分钟。按BCIP:NBT:稀释液=1:1:50的比例配制显色液（其中，稀释液在使用前，先用 蒸馏 水将浓缩的稀释液一次性稀释为工作液，密封4°C保存），混匀后立即将显色液和膜封入杂交袋中，置暗处反应，待显色反应达到最佳程度时，取出膜，用 蒸馏 水漂洗终止反应，晾干后封入塑料袋中保存。

6、照相保存结果进行分析