蛋白质的定量测定方法：微量凯氏定氮法

【 实验目的 】
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
【 实验原理 】
    凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量,若蛋白质的含氮量已知时，则可用此法测定样品中蛋白质的含量。
    当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。
消化完成后，在凯氏定氮仪中加入浓碱，可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借助水蒸汽蒸馏法，将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中氢离子结合，使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂颜色改变，然后用标准无机盐酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止。根据所用标准盐酸的量可计算出待测物中的总氮量。
蛋白质的含氮量为16%，即1克蛋白质中的氮相当于6.25克蛋白质，用凯氏定氮法测出的含氮量乘以6.25,即得样品中蛋白质的含量。
【实验材料】
1. 实验器材
微量凯氏定氮仪  1套；50ml凯氏烧瓶  4个；移液管；锥形瓶；试管；小玻璃珠
2. 试验 试剂
(1) 浓硫酸；30％氢氧化钠溶液；2％硼酸溶液；标准盐酸溶液(0.01mol／L)。
(2) 粉末硫酸钾—硫酸铜混合物 ：K ₂ SO ₄ 与CuSO ₄ ·5H ₂ O以3：1配比研磨混合。
(3)混合指示剂(田氏指示剂)：由50ml 0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200ml 0.1％甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。
(4) 样品溶液：配制3mg/ml的牛血清白蛋白溶液作为样品。
【实验操作】
1.安装凯氏定氮仪。
2.消化：取4个50ml凯氏烧瓶并标号,各加1颗玻璃珠，在1号及2号瓶中各加样品1ml，催化剂(K ₂ SO ₄ - CuSO ₄ ·5H ₂ O)200 mg，浓硫酸5 ml。注意加样品时应直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3号及4号瓶中各加1 ml 蒸馏 水和与1、2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照。在通风橱内进行消化。
    在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待硫酸开始分解并放出SO ₂ 白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。撤掉火力，冷却至室温。