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微量凯氏(Micro-Kjeldahl)定氮法测定蛋白质含量

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【实验原理】
蛋白质(或其它含氮有机化合物)与浓H2SO4共热时,其中碳、氢两种元素被氧化成CO2和H2O,而氮元素转变成NH3,并进一步与H2SO4反应生成(NH4)2SO4,残留于消化液中,该过程通常称为“消化”。以甘氨酸为例:
CH2NH2COOH + 3H2SO4 → 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3
2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4
但是,该反应进行得很缓慢,消化费时较长,通常需加入K2SO4或Na2SO4以提高反应液的沸点,并加入CuSO4作为催化剂,以加速反应的进行;氧化剂H2O2也能加速反应。消化完毕后,加入过量浓碱(如NaOH)使消化液中的(NH4)2SO4分解放出NH3,以蒸馏法借水蒸汽蒸出的NH3,用一定量、一定浓度的H3BO3溶液吸收。NH3与酸溶液中H+结合成NH4+,使溶液中的H+浓度降低,然后用标准强酸(如盐酸)滴定,直至恢复溶液中原来的H+浓度为止。
(NH4)2SO4? +? NaOH → Na2SO4 + 2 NH4OH
NH4OH? → NH3? + ?H2O
3NH3 + H3BO3 → 3 NH4+ + BO33-
BO33- + 3H+ → H3BO3
最后根据所用标准酸的量计算出样品中的含氮量。大多数蛋白质的含氮量平均为16%,所以将测得的蛋白质的含氮量乘以蛋白质系数6.25(即每含氮1g,就表示该物质含蛋白质6.25g),即可计算出蛋白质的含量。
器材和 试剂
(一)器材
1. 100ml凯氏烧瓶
2. 改进型凯氏定氮仪
3. 50ml容量瓶
4. 分析天平(电子天平)  
5. 烘箱
6. 电炉
7. 酒精灯
8. 小玻璃珠
9. 滴定管
10. 洗瓶
11. 锥形瓶
12. 铁架台
13. 普通面粉或其它样品
(二) 试剂
1. 消化液
30% H2O2∶浓H2SO4∶H2O    =3∶2∶1
2. 30% NaOH溶液
3. 2% H3BO3溶液
4. 混合催化剂(粉末K2SO4- CuSO4混合物)
K2SO4与CuSO4以3∶1比例充分研细混匀。
5. ?0.01mol/L标准盐酸溶液
6. 混合指示剂(田氏指氏剂)
取0.1%甲烯蓝-无水乙醇溶液50ml、0.1%甲基红-无水乙醇溶液200ml,混合,贮于棕色瓶中备用。该指示剂酸性时为紫红色,碱性时为绿色,变色范围很窄(pH5.2~5.6)且很灵敏。
7. 蒸馏 水
【实验步骤
(一) 改进凯氏定氮仪的构造和安装
改进型凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反应室及冷凝器三部分组成。 蒸馏 装置的结构如图所示,可分成三部分来叙述:
1. 蒸汽发生器和反应室:蒸汽发生器有3个开口(图中的3、4、5);反应室有1个开口(图中的6)。
2. 冷凝器和通气室:冷凝器有2个开口(图中的9、10);通气室有2个开口(图中的12、13)。
3. 排水柱: 排水柱有3个开口(图中的15、16、17)。
安装时,按图的连接方式仔细安装在一平稳的实验台上。先将主体部分固定在铁架台上,其底部放上电炉或酒精灯。然后将5与13;4与16;12与15;6与7用橡皮管连接,并夹上自由夹。最后长橡胶管连接进水口10和出水口17。

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