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改良微量凯氏定氮法测定血清蛋白质总量

互联网2013-11-13

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实验原理

蛋白质是机体内主要的含氮物质，而且氮元素的含量相当恒定，一般为16％，其它非蛋白质的含氮化合物所占的氮量甚微。因此，测定生物样品的含氮量，即可推算蛋白质含量。

测定生物样品中的含氮量，最常用的方法是凯氏定氮法，本实验采用改良微量定氮法，其原理是：

1. 氧化并固定有机氮质（消化）：以强氧化剂（浓硫酸，亚硒酸）与稀释血清混合加热、消化，血清中的有机物质全部分解，大部分氧化逸出（如CO2↑、SO2↑、H2O↑），氮则以（NH4）2SO4形式被固定下来。

2. 显色、比色：硫酸铵与碱性的纳氏（Nessler）试剂作用，生成棕色胶体溶液，然后与用同样方法处理的标准硫酸铵溶液比色，计算血清总氮量。

　　（NH4）2SO4＋2NaOH——→Na2SO4＋2NH4OH

　　2NH4OH＋2（KI2）•HgI2——→NH2Hg2I3＋4KI＋NH4I＋2H2O

　　　　　　碘化钾汞双盐　　　　碘代双汞胺

3. 血清中含有非蛋白质的含氮化合物（如尿素、尿酸、肌酐、肌酸、氮、氨基酸等），其中所含的氮称为非蛋白氮（Non protein nitrogen）通常简写为N．P．N。测定时需先将血清制备成无蛋白血滤液、再经消化、显色、比色即可测知血清非蛋白氮含量。本实验采用钨酸法制备无蛋白血滤液，其原理为钨酸钠与硫酸作用生成钨酸，后者使蛋白质沉淀，过滤可得无蛋白血滤液

　　Na2WO4＋H2SO4——→H2WO4＋Na2SO4

4. 血清总氮量减去非蛋白氮量即为蛋白质含氮量，根据蛋白质含氮量为16％，即可将氮量换算为蛋白质量。

实验步骤

1. 制备无蛋白血滤液：用移液管吸取血清0.50m1，置于中试管中。加蒸馏水4.00ml混合，再加10％钨酸钠0.25ml，混匀，然后加入2/3 N H2SO4 0.25ml。随加随摇，静置5分钟后过滤，滤液必须无色透明，否则需重过滤或再制备。

2. 稀释血清：用移液管吸血清0.25ml置于50ml容量瓶中，加生理盐水至刻度，颠倒混合数次以保证充分混匀。

3. 消化：准确吸取稀释血清和无蛋白滤液各1.00ml，分别置于2支硬质试管中，加消化液0.20ml，混匀，加入玻璃珠1粒，用木夹夹住试管，于酒精灯上先均匀加热，然后把试管竖直，于管底部加热煮沸后，消化5~8分钟（注意调节玻璃管与火焰之间的距离，以使管内液体保持沸腾，而又必须防止液体外溅，否则影响测定结果的准确性）。管内液体由无色逐渐转变为黑色，此时并有白烟充满试管，继续消化，倾刻间管内液体由黑色变为棕色再转变为无色透明，即可移开或熄灭灯火。在室温冷却后显色。

4. 显色：将上述第3步消化后的两支试管分别标明测定（u）及NPN（其中各有消化后溶液约0.1ml），并另取洁净干试管2支，分别标明标准（S）及空白（B）按下表操作：

	测定（u）	NPN	标准（S）	空白（B）
硫酸铵标准液（0.04mg/ml）ml	－	－	1.00	－
消化液ml	－	－	0.20	0.20
蒸馏水ml	6.90	6.90	5.80	6.80
纳氏试剂ml	3.00	3.00	3.00	3.00

充分混合后比色。显色液必须清晰透明，不应混浊。

5. 比色：用空白管调零，以蓝色滤光片或440nm波长比色，分别记录各管光密度。

6. 计算：根据比色法原理及公式计算：

（1）血清N．P．N含量mg/100ml

（2）血清蛋白质含量g/100ml

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