提高PCR 产物的几种有效方法

( 1中国农业科学院作物品种资源研究所　农业部作物种质资源与 生物 技术重点开放实验室,北京100081 ;
2　河北农业大学农学院,保定071001)

摘　要: 　结合作者的工作实际,着重介绍了有效提高PCR 产物的几种方法:如怎样高效快速地设计PCR 引
物,怎样尽快确定PCR 反应的最适退火温度,如何提高GC 富集区的扩增效率等,为分子 生物 学工作者提供一些可
以借鉴的方法及经验。
关键词: 　 聚合酶 链式反应　PCR 引物　GC 富集区　梯度PCR
Several Methodologies on Improving the PCR Products
Li Aili1 , 2 　J iang Tao1 　Ma Zhiying2 　J ia J izeng1
( 1 Key L aboratory of Crop Germplasm Resources and Biotechnology Mi nist ry of A gricult ure Instit ute of
Crop Germplasm Resources Chi nese Academy of A gricult ural Sciences , Beiji ng 100081 ;
2A gricult ural University of HeBei , Baodi ng 071001)

Abstract : 　Combining the author’s working experiences , we introduce here several methodologies on improving the
PCR products , such as the disciplines which we should abide by when we design PCR primers ; how to determine the ap-propriate annealing temperature of the PCR reaction ; how to improve the amplifying efficiency of the GC rich region. We hope to provide some methodologies for those who do research in microbiology.
Key words : 　Polymerase chain reaction 　PCR primer 　GC rich region 　Gradient PCR

　 聚合酶 链式反应(polymerase chain reaction ,PCR) 最早由Mullis 于1987 年发明,现已成为实验室常规的操作,并已实现自动化。随着该技术的日趋成熟与完善,它已被广泛应用于分子生物学研究的各个领域。采用PCR 技术可以有效地从基因组DNA 或cDNA 文库中扩增目的基因,用以改良农作物或其它有用生物的性状,为人类造福。但在实际操作中,PCR 引物设计, PCR 反应最适退火温度的选择以及GC 富集区的扩增效率等问题常常成为该技术的制约因素,导致较长时间内扩增失败,耗费大量时间,精力,物力。笔者在这方面积累了一些工作经验,现整理如下,以供参考。
1 　引物设计
1. 1 　计算机软件辅助设计
PCR 引物设计是PCR 反应能否进行的关键。目前,可用于PCR 引物设计的软件非常多, 例如DNAstar ,Oligo6 ,Primer3 等。常用的是DNAstar 软件包中的Primerselect 。假如有一条基因序列需要设计引物,先要把这条序列保存为. txt 文件,然后利用DNAstar 中的Edit seq 把纯文本文件转换为. seq文件,这样就可以进行引物设计了。对于引物参数的取值可根据自己实验的要求来设置。通常情况下,应用软件设计引物具有方便,快速等优点。但是对于一些有特殊要求的PCR 反应来说,例如SNP的DASH 检测,其PCR 引物设计应用上述软件均不能获得有效引物,这时,实验者就应考虑根据PCR引物设计的原则并结合自己的经验设计引物。
1. 2 　引物设计原则
在设计引物时,应注意遵循以下原则。
(1) 引物的长度一般在17～24 个寡 核苷酸 。
如果退火温度在54 ℃或稍高即能保证PCR 扩增的特异性和有效性,尽量缩短引物的长度可提高PCR扩增效率;如果扩增片段异源性较强,如同工型(io-form) 或利用一种植物已知基因序列扩增另一植物中基因时,应适当增加引物长度,引物可增至28～35 个碱基,从而提高PCR 扩增的特异性。如我们在应用拟南芥抗白粉病基因RPW8 1 应用于RT2PCR 的引物RPW81C 来扩增小麦基因组时,选用的基因长度上下链均为33bp ,
Forword :5′-CCGGAATTCATGCCGATTGGTGAGCTTGCGATA-3′
Reverse : 5′-CGCGGATCCTCAAGCTCTTATTTTACTACAAGC-3′
一次即获得了特异性较高的PCR 产物(图1) 。

图1 　用引物RPW81C 进行RT-PCR 的扩增结果