如何提高PCR产物克隆的效率

互联网2013-09-06

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把PCR产物克隆到载体上常见有3种做法：

1. 直接克隆到T载体（或者U载体上）

2. 引物设计时引入酶切位点，PCR产物酶切后直接克隆到目标载体上

3. 将平末端PCR产物直接克隆到平末端酶切载体上。

方法3主要是针对高保真的聚合酶比如Stratagene公司的Pfu酶，NewEnglandBiolabs公司的Vent酶，以及QIAGEN公司新出的同时具有热启动功能的高保真ProofStart酶，进行PCR扩增，由于这类酶有很强的校读功能，能够以模版为准切掉错配的碱基，因而得到的PCR产物多数是平末端，不能用T载体克隆。

通常需用目的载体多克隆位点上的平末端单酶切位点，单酶切得到平末端的线性片断，直接连接PCR产物。这类酶得到的产物通常不能用TA克隆试剂盒。目前也有商业化的平末端PCR产物克隆试剂盒，不过较少用。

平末端的连接效率低，通常需要高浓度的连接酶，较长的连接时间，合适的片断：载体比例，有的时候还需要调整反应体系的ATP浓度或者增加聚乙二醇（PEG2000），以得到较高的连接效率。许多厂家都有推出快速连接试剂盒，比如NewEnglandBiolabs新出的5分钟快速连接试剂盒，能够简化平端连接步骤和条件，缩短连接时间，提高连接效率。

不过需要注意的是一些厂家（例如Clontech、Gibco/BRL、Roche）也生产一些用于PCR的高保真混合酶，是采用常规Taq酶和一些有校读功能的（proofreading）的聚合酶按比例混合（这样得到的混合酶的保真性比普通Taq酶高一点，但通常不如Pfu、ProofStart等酶），因而得到的PCR产物也是平端和A末端的混合产物，是否能用TA克隆试剂盒需要参考厂家的说明。

方法2是比较常用的经济的方法，不需要购买T载体，可以直接通过酶切PCR产物，得到粘末端，直接连接到目的载体上。在顺的时候，这种方法是非常简单的。

可有时候也会出问题，双酶切就是连不上，比较常见的原因是PCR产物双酶切不完全，比如没有纯化产物就直接双酶切，有的酶比较“娇气”容易出现“切不动”或者是“星号活力”，得不到正常的粘末端而连不上。

有时是因为选定的两种酶反应条件相差比较大，为了省事同时双酶切（通用Buffer不是一定通用的，不能过分迷信，有时会成为莫名其妙出错的根源），也会出现类似的错误。

还有一种情况是由于有些酶在酶切时需要一定的“占位空间”，也就是要求酶切识别序列的前后有一定数量的碱基才能正常酶切，而设计引物时酶切位点直接就在5'末端，没有留下足够的保护碱基而导致PCR产物酶切不动，无法正常的克隆。由于这些错误很难检查，有的时候会浪费大量的时间，还是莫名其妙没有结果。

由于常见的Taq酶或者没有校读功能的DNA聚合酶（即不是高保真）在PCR扩增的时候通常会在PCR产物末端多添加一个A（即增加一个模版上不存在的A）。这个突出的A成为PCR产物TA克隆技术的基础。带有互补的突出T末端的线性载体能够有效提高PCR产物的克隆效率，解决方法2遇到的难题，所以方法1也是目前比较常见的方法。

TA克隆在顺的时候也很简单，简直就是“apieceofcake”，不用考虑酶切位点，引物设计等等问题，好的载体克隆效率高、重组率高而且两端有丰富的单酶切位点便于后继的克隆，但是烦的时候也会出现无缘无故克隆不上或者重组率很低的问题。

比较容易忽略的问题是用高保真的酶进行PCR扩增，应该选用平端克隆载体而错用了TA载体。常见但很难解决的问题则是由于T末端容易和其他碱基错配而导致自身环化或者克隆了引物/自身褪火引物二聚体或者PCR不完整产物，因而出现假阳性。

因而QIAGEN公司推出了UA克隆试剂盒，用突出的U末端代替T末端，由于U碱基能够有效减低和其他碱基（T、C、G）非特异退火的几率，因而能有效提高PCR产物的克隆效率。

但是，是否还有其他因素会影响PCR产物的克隆效率呢？最近，QIAGEN公司的研发专家发现，PCR引物5'端的碱基（也就是引物第一个碱基）的不同，会影响PCR产物的克隆效率！以后设计引物可要注意了！看看QIAGEN的专家怎么说――

RalfPeist,DorotheeHosel,TheaTutjes,andDirkLoffert

基于UA的克隆技术广泛应用于PCR产物的快速、简便和高效的克隆。由TaqDNA聚合酶为PCR产物添加的多出来的一个A碱基能够和pDriveCloningVector（QIAGENPCRCLoningKit提供）载体上的互补的U碱基配对结合。PCR产物能够高效地结合到载体上，无需在引物中引入限制性内切酶位点，无需酶切或者平端连接。

在某些特殊情况下，由于一些未知的原因，一些表面很正常的PCR产物的克隆效率却很低。在这里，我们证实：PCR引物的5'末端碱基能够显著影响TaqDNA聚合酶添加A末端的效率――有的时候导致只有一小部分PCR产物带有A末端，从而使PCR产物克隆效率明显降低。

在这里我们提供一些简单的建议如何提高这些“难克隆”的PCR产物的克隆效率。

材料和方法

GeneScan 分析以确定PCR产物的长短

用QIAGEN公司的QIAprepSpinMiniprep提取质粒pTZ19R。采用没有校正功能的DNA聚合酶和特异性引物分别扩增质粒上的112bp、213bp和363bp片断。

每个片断的扩增都分别进行4组反应，采用同一个荧光标记的正向引物（forwardprimer）和4个不同的反向引物之一进行扩增，4个reverseprimer的区别仅在于引物的5'端碱基分别为（A、T、G、C），其他序列都相同。PCR产物用ABIPRISM377测序仪分析，并用ABIGeneScan分析软件进行分析。

分析克隆效率

用DNeasyTissueKit和QIAampDNABloodMiniKit分别纯化小鼠和人类基因组DNA。用QIAGENTaqDNA聚合酶或者HotStarTaqDNA聚合酶分别扩增小鼠p53基因上一段500bp的片断、人类prion蛋白基因上一段750 bp的片断，以及人类白介素9基因上一段1000 bp的片断。

每个片断的扩增都分别进行4个反应，分别采用4对引物（区别仅在于5'末端碱基分别为A、T、G、C，其他序列相同，如表1）进行扩增。PCR产物克隆到QIAGENPCR克隆试剂盒中的pDriveCloningVector中。计算克隆数，以其中一组5'端带A碱基的克隆数为基准（normalizedto）进行比较,结果如图。

表一：扩增人白介素9基因中1kb的一段序列的引物组合：

PCRfragment Forwardprimer ReversePrimer

A 5'-ACTC. . . TGC-3' 5'-ACGC. . . TGT-3'

C 5'-CCTC. . . TGC-3' 5'-CCGC. . . TGT-3'

G 5'-GCTC. . . TGC-3' 5'-GCGC. . . TGT-3'

T 5'-TCTC. . . TGC-3' 5'-TCGC. . . TGT-3'

结果和讨论

1. 引物的5'末端碱基对添加A末端反应的影响

没有校读功能的DNA聚合酶如Taq酶，会在PCR产物的3'末端添加多一个A（即：比模版多加一个A）为了比较引物的5'末端碱基对添加A末端反应的影响，我们比较了3个不同片断的各4组PCR产物的长短。

结果表明：引物5'末端是A碱基的，PCR产物末端添加A的效率最高。引物5'末端是G的，PCR产物末端添加A的效率也很高，但是反应时间的延长，会导致添加2个A，从而影响后继的PCR产物克隆。

2. 引物5'末端碱基对PCR产物克隆效率的影响，以及连接时间对克隆的影响

既然引物的5'末端碱基的不同会影响PCR产物末端添加A的反应效率，我们也研究了这种现象对PCR产物克隆的影响。

结果表明PCR产物克隆效率与添加单个A碱基的效率正相关，引物5'末端是A的PCR产物得到的重组阳性克隆（insert-bearingcolonies）最高。不同长短的片断克隆结果都证实了这一点。因此，引物设计时应该尽可能在5'末端添加A碱基。

如果引物设计时5'末端无法加A，延长连接时间能够弥补克隆效率的不足。30分钟的连接时间能够保证引物末端带A的PCR产物有足够高的克隆效率。如果延长连接时间到2小时，能够显著提高引物末端带C的PCR产物克隆效率。

结论

1. QIAGENPCRCloningKit能够简单快速将PCR产物克隆到PCR载体中，采用QIAGEN试剂盒中特制的感受态细胞，只需要40分钟可以完成从克隆到涂板的全过程。

2. 偶然，PCR产物克隆效率会意外的低，此时可以通过设计一对5'端带A的引物（引物的第一个碱基是A），这样可以提高Taq酶在PCR产物末端添加A的效率，从而提高PCR产物在UA（TA）载体的克隆效率。

3. 如果不能在引物5'端加A，可以通过延长连接时间来提高克隆效率。