如何提高转染实验的效率

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在本章节我们解释了转染 体系的关键组分对细胞转染实验的效率有何影响，并且合理的给予您一些关于如何使它们更有利于您研究方面的提示。

【组织培养试剂】

一般提示：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并经可能减少所用试剂的变更。

基础培养基—目前所使用的各种市售培养基(如，RPMI 1640和DMEM )。培养基的成分包括营养物质(氨基酸，葡萄糖)，维生素，无机盐，和缓冲物质。有些成分非常不稳定，因此如果不在使用时新鲜加入就可能会产生问题。务必要使培养基避光保存。因为已知有一些组分和缓冲物质，如HEPES，当暴露于光照下就会分解产生细胞毒性物质。

酚红试剂可保护细胞免受一些HEPES降解所产生的毒性效应，但在使用未加酚红试剂的培养基的应用场合下，如荧光素酶的测定，细胞毒性则仍然是一个问题。

胎牛血清—血清是一种含有白蛋白、球蛋白、生长促进因子和生长抑制因子的极为复杂的混和物。采集血清所用动物的年龄、营养水平、和健康状况可影响到血清中这些成分的数量和质量。因此血清易受显著生物学变异的影响。

添加剂—某些细胞的生长依赖于一些对生命力或细胞分裂 必不可少的物质(如，生长因子，微量元素，必需代谢物和蛋白等)。

CO2培养箱—细胞生长所需环境为37℃、相对湿度为95%的CO2培养箱。用CO2是为了控制pH值。细胞生理对pH的变化非常敏感，因此多数细胞培养 基都含有碳酸氢盐缓冲体系。有些培养基需要CO2 浓度为5%来有效控制pH值，而另一些则需要10%的CO2。需要向您的培养基供应者核对一下适当的CO2浓度。如果培养箱内培养条件与所需条件不一致(温度、湿度和CO2)则会导致实验结果的板间变异性。来自于培养箱内的污染物、化学物质，或真菌/细胞的污染也都可能影响到细胞生理

【细胞】

一般提示：密切观察您的细胞;确保它们状态良好。在开始转染 细胞之前，先制定一个适当的种板方案，使细胞密度从转染开始到结束都保持最佳状态。

增加成功几率—细胞是转染过程中的一个关键元素，它可以是影响结果的一致性和质量的最重要的变量。为帮助解决这些问题，罗氏应用科学部与ATCC®(美国菌种保藏中心)进行了合作。

为保证将被转染细胞的质量，罗氏应用科学部建议使用新近从ATCC®获得的细胞系。

分裂细胞相比较非分裂细胞—分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于生长过度的状态。由于FuGENE® 6和HD转染试剂对于细胞作用温和，可同时进行贴壁细胞的种板和转染。

此外，还常用促有丝分裂刺激物(如，病毒转化，生长因子，条件培养基，以及滋养细胞)来活化原代培养细胞。

贴壁细胞相比较悬浮细胞—在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。天生趋于悬浮的细胞(如HL 60，Jurkat)非常难以转染。相反，天生为贴壁的细胞(如HEK，CHO)则可适应悬浮生长的条件。

这两种细胞(即那些天然悬浮的和那些适应悬浮的细胞)的浆膜是不一样的。据推测转染过程中的一个限制步骤就是通过内吞作用摄取转染分子(DNA或RNA与转染试剂的复合物);然而，目前对此尚未有分子水平上的合理机制的解释。细胞间膜结构的差异可能是某些细胞类型天生难以转染的部分原因。所以，寻找更有效转染试剂的工作目前还主要是经验性的，尤其对于那些天生为悬浮的细胞而言更是如此。

这常常是在不含血清而含有抑制转染的特殊添加剂的培养基中发生。经小心处理后，这些细胞可适应于在没有添加剂的环境中悬浮生长。如果这些适应于悬浮生长的贴壁细胞在没有这些添加剂的环境中生长，那么它们就可以被转染。

分批方案—在对培养细胞进行分批传代培养之前，必须把贴壁细胞用胰蛋白酶消化使之脱离培养基质。这个常规操作可导致正常细胞功能受到严重损害。因此分批方案的不同(如，胰蛋白酶消化时间的延长，胰蛋白酶的失活，以及消化后直到转染开始的时间)都可能对转染实验有所影响。

如果在转染时细胞过于密集，那么种到培养板上的就会是细胞团块而非单个细胞。

对于某些细胞/试剂组合而言，浆膜状态被改变后有可能会影响到所用试剂和DNA的最佳配用量和配比。

传代次数—传代次数是指对一个细胞系进行分批传代的频度(通常在一个实验室范围内)。在某些情况下，自建立细胞系起的确切传代次数无法得知。

某些细胞系相比较其他细胞系而言较不稳定，可能会随着培养时间的延长而改变，视不同的细胞系和培养条件而定。培养条件的不同可引起克隆选择。因此名称相同的同一细胞系有关其生理学和形态学(以及转染能力)性质可能会有很大的差异。

一般而言，细胞在冻存复苏后的一两代之内或直到它们完全复苏之前都很难转染。在不同细胞系之间转染效率的变化很大。某些细胞系在传代很大次后仍能保持稳定的转染效率，而其他一些则传代很少次数就表现出转染效率的差异。

细胞数量(汇聚度)—只要培养基质(组织培养皿)尚有空间，细胞就会按指数规律分裂。对于正常细胞而言，细胞生长的速度受细胞密度大小的抑制(接触抑制)，但癌细胞则不受此限制而会继续生长并可互相叠加。

营养物质的耗竭以及代谢废物的积聚会影响所有的细胞生长。细胞会因受到营养物质匮乏的压力而不适于转染。

报告基因的表达率与转染开始时的细胞数量和细胞健康以及它们随后直到细胞溶解之前的生长情况相关。

培养物污染—培养物可被细菌、酵母、真菌、病毒、支原体、甚至其他细胞种类所污染。各种污染都会导致产生错误的结果。

支原体污染—支原体污染在所有培养细胞中的比例为5-35%，它可改变细胞生长特性，酶的作用途径，细胞膜的组成，染色体结构，以及转染效率。特别是，支原体对采用脂质、DEAE-右旋糖酐、磷酸钙或腺病毒介导的转染技术有所干扰，其结果致使转染效率偏低或非典型。这些效应会导致实验结果的不可靠以及时间和珍贵细胞系的损失。

和细菌及真菌不同，支原体污染无法通过视觉检查发现。它们非常小甚至能够通过大多数的无菌滤膜;它们还对常用抗生素有抗药性。所以必需进行支原体污染的常规筛查。

罗氏应用科学部提供支原体检测试剂盒以帮助尽早发现支原体污染。

交叉污染—如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。众所周知有许多细胞系被HeLa细胞所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。这种变化是逐渐发生的;而您可能甚至还未发现。

建立细胞系鉴定的检测标准。例如，对于人类细胞系而言，STR(短串联重复序列)图谱就是一种可靠的鉴定方法。或者更简单的解决方案就是，当怀疑有交叉污染时，如果有可能，就换用新鲜的，传代次数少的细胞源。

【载体DNA】

一般提示：对您纯化所得的载体进行质量检查。确定支持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在对您细胞体系的参数进行测定时，一定要选用一种您已知具有功能的对照载体。

载体的完整性—种载体是否具有功能取决于它结构的完整性。转染效率受到质粒制备物的超螺旋结构和舒展结构之间比例、双螺旋中断、核酸酶的降解，以及来自于储存和处理过程中的物理压力的影响。

载体制备物-各种载体是按照不同的方案在细菌体系中制备并纯化。制备产物中残余的污染物(如CsCl，内毒素)可能会影响转染效率。

载体构造(启动子/增强子/ORI)—转染体系通常用带有强病毒调节元件(如，RSV，CMV，和 SV40)的对照载体进行优化和比较。然而，病毒启动子/增强子体系的相对有效性在不同细胞系间的差异可大到两个数量级。例如，在某些细胞系中，由于自发的质粒扩增，SV40体系可高效表达 large T抗原(如，COS);而在其他许多细胞系中，则是CMV启动子更为有效。

除此之外，各种CMV载体的表达率也会有超过一个数量级的差异，这部分是由于载体中其他调节元件所引起的。

【转染方案】

一般提示：建立一套适当的转染方案;首先从一种标准方案开始，然后通过改变试剂/DNA的配比和形成复合物的数量进行优化。

转染复合物的制备—诸如转染试剂/DNA配比，离子强度，缓冲液pH值，以及温度等变量都会影响到转染复合物的组成和功能。质粒既可在无菌水又可在TE缓冲液中稀释。如果您要使用一种市售的转染试剂，就应当仔细阅读该试剂所提供的使用说明。需要对试剂提供方给予一定的信赖;除非您有很好的理由支持您做出改变，否则就应当严格按照他们所推荐的转染方案。在不含血清或其他蛋白的培养基中制备转染复合物;如果制备复合物所使用的培养基含有血清，它就会对转染产生抑制。

制备转染复合物的最佳孵育时间是一个非常关键的环节，对于不同的转染试剂而言可能差别很大。

转染试剂/DNA配比(负载比)—所有的转染试剂都会在某一个试剂/DNA配比时最为有效。有时候这种最佳配比的所在范围非常狭窄;而且对于每种实验体系都必须进行优化才能得到最佳配比。为了寻找这种最佳配比往往会花费大量的时间和金钱。

除了配比的重要性之外，所加入转染复合物量的多少也非常关键。

形成转染复合物所用的稀释剂—对于多数试剂而言，很关键的一点是要使转染复合物能在普通基础培养基和盐溶液中形成。

FuGENE® HD 转染试剂则是一个例外，因为它能在水中、不会血清的培养基中或含有10%血清的培养基中生成复合物。如果您使用的是水或含有10%血清的培养基，则应保证它能适用于你特定的细胞体系。

复合物数量—对转染细胞所用的转染试剂/DNA复合物的量也应当进行优化。如果用量太少，那么转染DNA的表达就太弱;如果用量太多，则可能由于细胞毒性或其他作用反而降低蛋白的表达。最佳用量通常都必须进行实验来确定。

这种影响用FuGENE® HD 转染试剂进行实验时尤其明显。

而用FuGENE® 6转染试剂进行转染时则是一个例外，因为它在一个很宽的转染复合物用量范围内都会得到很好的转染结果。在很多情况下，FuGENE® 6 转染试剂的这种特性使得不再需要对转染剂量进行优化过程。

所需要的转染复合物用量与所用细胞的数量相关。转染细胞越少，所需复合物就越少。

转染复合物的加入—有两种替换方法可用来浆转染复合物加入转染细胞：1. 将复合物浓缩液逐滴加入培养基，或者2. 将转染复合物先用培养基稀释，然后进行培养基更换操作。第一种方法更简便，而第二种方法则更因为避免了试剂在局部浓聚而产生毒性，所以会使结果的一致性更好。

对于诸如FuGENE® 6 转染试剂和HD转染试剂这类的温和试剂而言，您可以先将转染复合物加入培养容器，然后再加入用胰蛋白酶新鲜消化得到的细胞。

转染培养基—转染过程中所使用的培养基对转染效率可能会有正面或负面的影响。甚至对于基础培养基配方而言也是如此，尤其是在培养基中加入牛血清的情况下。胎牛血清的存在会使多种转染试剂的转染效率降低. 某些公司还提供可与转染试剂配合使用的优化无血清转染培养基。而由罗氏应用科学部所提供的转染试剂则无论是否存在血清都能有效转染。

FuGENE® H D是独一无二的能够转染保存在100%血清中肿瘤细胞的转染试剂。

如果有抗生素(如，青霉素、链霉素、或两性霉素B)存在的情况下培养细胞，则转染有效性会降低至25%。因此，对于瞬时转染，我们建议使用不加抗生素的培养基。

【时间进度】

一般提示：要确保最终结果的成功;建立一个合适的时间进度进行转染实验以保证您所需要的目标蛋白能得到最佳表达。

转染的开始—在转染前12小时，将细胞分种于培养板中。在转染开始时，培养物应当有约50-80%汇聚，这样就可以使它们在实验结束时达到接近100%的汇聚。

如果在转染中去掉血清，细胞可能会暂时停止生长。

细胞对转染复合物的摄取通常在0.5-6小时的时间内完成。在这段时间后，就不会再发现转染效率有所增长。

培养基更换—某些转染试剂在摄取阶段之后需要更换培养基。如果转染必须在没有胎牛血清存在的条件下进行，那么这一步骤就必不可少。至于可在血清存在的情况下使用的无毒性转染试剂(如，FuGENE® 6 转染试剂或FuGENE® HD 转染试剂)时，如果有足够的培养基用于后续表达阶段，就可以省略这一步。

如果将转染复合物留在细胞中直到进行检测，那么对有些细胞系而言转染效率会有所提高，而另外一些细胞在转染开始几个小时之后其转染效率就不会再有升高。

虽然在转染步骤之后转染试剂/DNA复合物通常不一定要从培养体系中清除，但在此后的长期生长阶段换用新鲜的培养基却是必须的。如果转染细胞需要生长3-7天，换培养基就尤其重要，这样一来就使它们有时间达到最高的蛋白表达量。

时间测定—通常在转染开始后的24-48小时间分析报告基因的表达。在这一时间段内，报告基因产物的浓度逐渐增加;而这种增加取决于增强子的强度、在表达外源蛋白中所涉及的细胞反应，存活细胞的健康状态，以及营养因素等。

如果您要收集蛋白进行纯化，在转染后等待3-7天就更为常见了。在收集蛋白时，培养基中加入COMPLETE完全蛋白酶抑制剂(如，目录编号，11697498001;11836145001，可从罗氏应用科学部获得)用来防止蛋白降解是一个很好的措施。

参考文献

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FuGENE® H D Transfection Reagent: Choice of a Trans- fection Reagent with Minimal Off-Target Effect as Ana- lyzed by Microarray Transcriptional Profiling. Biochemica 4 (2006) 27-30.

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产品 包装大小 目录编号

FuGENE® HD 0.4 ml(可进行多达 04709691001

转染试剂 120次转染)

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300次转染)

5 x 1 ml(可进行多达 04709713001

1,500次转染)

FuGENE® 6 1 ml(可进行多达 11814443001

转染试剂 300次转染)

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120次转染)

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1,500次转染)

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(至少150 ml)

X-tremeGENE Q2 1.8 ml(可进行450 03036421001

转染试剂 次转染)

0.4 ml(可进行100 03045595001

次转染)

X-tremeGENE siRNA 1 ml(可在24孔板 04476093001

转染试剂 中进行400次转染)

5 x 1 ml(可在24孔板 04476115001

中进行2,000次转染)

DOTAP 脂质体 0.4 ml 11811177001

转染试剂 2ml(5x0.4 ml，2mg) 11202375001

DOSPER 脂质体 0.4 ml 11811169001

转染试剂 2ml(5x0.4 ml，2mg) 11781995001

为确保需要转染的细胞质量，罗氏公司建议使用新近购自ATCC®的，传代次数少的细胞系。更多信息请访问下列网站并登记定购信息。www.atcc.org