2×CTAB法植物总DNA提取

1. 液氮研磨1g左右的植物组织，转移到离心管中。改用研磨枪在冰上研磨，不加β-巯基乙醇
研磨时可加入适量的PVP、β-巯基乙醇。若CTAB准备2-3天内用完，则可将PVP、β-巯基乙醇直接加入其中。


2. 加入500µl的undefinedCTAB (60℃或65℃预热) ,颠倒混合均匀后在60℃或65℃水浴30m-1h小时,其间要上下颠倒混匀数次。
3.取出离心管，加入等体积的24：1（三氯甲烷：异戊醇），上下颠倒充分混合。
  若量多，则可以直接侧立于摇床上晃动10分钟。
4.12000转速离心5-10min。将离心管动作轻缓的取出转子，放置于离心管架上。
  a.离心后溶液分三层：上层为水相；中层为碎片和蛋白相；底层为氯仿
  b.迅速进入下一步，以免各相混合
5.用移液枪吸取管中上层水相，动作一定要轻缓，不可搅动其它两层。
a.此步骤要宁舍不贪多，尽量避免吸取到下层液体。
b.若上步骤中中间层较厚，则继续加入等体积24：1，再次抽提一次，直至中间层较薄。
6. 在抽提出的水相中加入1/3体积的5M的KAc及等体积的异丙醇（4℃预冷），轻轻晃动混合均匀后在-20℃沉淀。沉淀至少15分钟至过夜。
6-1 在抽提出的水相中加入1/10体积醋酸钠（pH5.2, 3M），混匀后，加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀15min至过夜。
6-3. 在抽提出的水相中加入加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀15分钟至过夜。
a.时间越长，DNA的产量越多，污染也越多
7. 12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，加入700µl 70%的酒精，上下颠倒数次，洗涤沉淀。12000转离心5-10m，去上清，倒置于吸水纸上数分钟。重复一遍。
8. 12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，最后置于超净工作台中吹干。
9. 在离心管中加入30-50µl的灭菌去离子水或者TE溶液，4℃放置数小时，使其充分溶解。
10.用琼脂糖凝胶检测结果。
11. -20℃—— -70℃低温保存。
 
去除总DNA中的 RNA污染 先做预扩增实验，若RNE污染无严重影响则舍去该步骤
A
1.  在总DNA溶液中加入灭菌去离子水或者TE溶液调整总体积至200µl, 加入10µ RNase-A（10mg/ml）4℃过夜，或者37℃ 1h .
2. 用等体积的24：1抽提。
3. 沉淀DNA——洗涤DNA——干燥DNA­——溶解DNA­—— -20℃—— -70℃低温保存。
 
B 直接加入10µ RNase-A（10mg/ml）后冷冻保存。
试剂 配方
1M Tris-HCl ( pH7.4, 7.6, 8.0 )

pH	浓HCl	Tris	去离子水
7.4	约70ml	121.1g	定容至1升
7.6	约60ml	121.1g	定容至1升
8.0	约42ml	121.1g	定容至1升

高温高压灭菌后，室温保存
注意：应该在溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH大约降低0.03个单位
 
5×TBE缓冲液

Tris	硼酸	0.5M EDTA （pH8.0）	去离子水
54g	27.5g	20ml	定容至1L

室温保存
 
50×TAE缓冲液

Tris	冰乙酸	0.5M EDTA （pH8.0）	去离子水
242g	57.1ml	100ml	定容至1L

室温保存
 
2×CTAB

成分	终浓度	已有溶液浓度	配100ml所加量
CTAB	2%		2  g
Tris-HCl（pH8.0）	100mM	1M	10 ml
EDTA	20 mM	0.5M	4 ml
NaCl	1.4M	5M	28 ml

 
0.5M EDTA （pH8.0）

二水乙二胺四乙酸二钠Na 2 EDTA·2H 2 O	NaOH	去离子水
186.1g	约20克	定容至1L

高温高压灭菌，室温保存。
注：只有pH值接近8.0时，EDTA才能完全溶解。溶解过程可在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
 
耗材准备：
 
需要灭菌者： 1.5ml 离心管 、研磨枪头、蓝色枪头、黄色枪头、
其他：卫生纸（吸水用）、镊子、封口膜、挑菌针、酒精灯、70%酒精、 离心管 架子、 离心管 盒子、移液枪。