植物总DNA 的快速少量抽提(CTAB法)
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DNA 分子是分子生物学研究的基本材料,依不同的实验目的可采取不同的抽提方法获取数量和质量不等的 DNA 。
实验目的:了解植物 DNA 抽提的主要方法,掌握 CTAB 法快速抽提水稻 DNA 。
实验材料及 试剂 : 水稻叶片, 1.5 × CTAB ,氯仿 / 异戊醇 (24:1) , 95% 乙醇或无水乙醇等
实验原理:植物 DNA 的抽提常采用两种方法:
(1) SDS 法: 离子去污剂,过程长,纯度高;
(2) CTAB 法:该方法简便、快速, DNA 产量高 ( 纯度稍次,适用于一般分子生物学操作 ) 。 CTAB 是一种非离子去污剂,植物材料在 CTAB 的处理下, 结合 65℃ 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、 DNA 被释放出来 。 CTAB 与核酸形成复合物,此复合物在高盐 ( >0.7mM ) 浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度 ( 0.1-0.5mM NaCl ) 下 CTAB - 核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后, CTAB- 核酸复合物再用 70 - 75% 酒精浸泡可洗脱掉 CTAB 。 再经过氯仿 / 异戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化 DNA ,最后经异丙醇或乙醇等 DNA 沉淀剂将 DNA 沉淀分离出来。
实验步骤:
1.采集适量幼嫩叶片,用液 N2 研成粉末, 0.4 g 装入 1.5ml 离心管中( -20 ℃预冷)。
2.预热 1.5 × CTAB 到 95 ℃,加 1ml 到装有叶片粉末的离心管中,混匀(防止冻融)。
3.立即置于 65 ℃水浴 30min ,每 5 min,上下颠倒 1 次。
4.12000g 离心 5 min。
5.吸取上清液约 600μl ,加入等体积( 600μl )氯仿 / 异戊醇 (24:1) ,上下颠倒数次,至下层液相呈深绿色为止。
6.12000g 离心 5 分钟。
7.取 450μl 上清于一新 1.5ml 离心管,加入 1ml 95% 乙醇和 45μl 10M NH4AC ,混匀,室温放置 10min 。
8.12000 g 离心 10min ,去上清,用 75% EtOH 浸洗沉淀,自然干燥约 30 min 。
9.加入 50μl 1/10 TE 或无菌水(含 20μg/RNase ),置于 4 ℃过夜,待 DNA 溶解后,检测 DNA 浓度及质量。
注意事项:
1.尽量取材幼嫩叶片,如太老,酚类物质多,必须用 10 mM 的β -ME 处理
2.研钵预冻,粉末至加 CTAB 前不要融化
3.24:1 的氯仿 / 异戊醇抽提时动作应轻柔,转移用的枪头最好是剪宽了的
4.所用 试剂 必需灭菌,手套
思考:
(1) DNA 降解的可能原因
(2)提高 DNA 产量的措施
实验目的:了解植物 DNA 抽提的主要方法,掌握 CTAB 法快速抽提水稻 DNA 。
实验材料及 试剂 : 水稻叶片, 1.5 × CTAB ,氯仿 / 异戊醇 (24:1) , 95% 乙醇或无水乙醇等
实验原理:植物 DNA 的抽提常采用两种方法:
(1) SDS 法: 离子去污剂,过程长,纯度高;
(2) CTAB 法:该方法简便、快速, DNA 产量高 ( 纯度稍次,适用于一般分子生物学操作 ) 。 CTAB 是一种非离子去污剂,植物材料在 CTAB 的处理下, 结合 65℃ 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、 DNA 被释放出来 。 CTAB 与核酸形成复合物,此复合物在高盐 ( >0.7mM ) 浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度 ( 0.1-0.5mM NaCl ) 下 CTAB - 核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后, CTAB- 核酸复合物再用 70 - 75% 酒精浸泡可洗脱掉 CTAB 。 再经过氯仿 / 异戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化 DNA ,最后经异丙醇或乙醇等 DNA 沉淀剂将 DNA 沉淀分离出来。
实验步骤:
1.采集适量幼嫩叶片,用液 N2 研成粉末, 0.4 g 装入 1.5ml 离心管中( -20 ℃预冷)。
2.预热 1.5 × CTAB 到 95 ℃,加 1ml 到装有叶片粉末的离心管中,混匀(防止冻融)。
3.立即置于 65 ℃水浴 30min ,每 5 min,上下颠倒 1 次。
4.12000g 离心 5 min。
5.吸取上清液约 600μl ,加入等体积( 600μl )氯仿 / 异戊醇 (24:1) ,上下颠倒数次,至下层液相呈深绿色为止。
6.12000g 离心 5 分钟。
7.取 450μl 上清于一新 1.5ml 离心管,加入 1ml 95% 乙醇和 45μl 10M NH4AC ,混匀,室温放置 10min 。
8.12000 g 离心 10min ,去上清,用 75% EtOH 浸洗沉淀,自然干燥约 30 min 。
9.加入 50μl 1/10 TE 或无菌水(含 20μg/RNase ),置于 4 ℃过夜,待 DNA 溶解后,检测 DNA 浓度及质量。
注意事项:
1.尽量取材幼嫩叶片,如太老,酚类物质多,必须用 10 mM 的β -ME 处理
2.研钵预冻,粉末至加 CTAB 前不要融化
3.24:1 的氯仿 / 异戊醇抽提时动作应轻柔,转移用的枪头最好是剪宽了的
4.所用 试剂 必需灭菌,手套
思考:
(1) DNA 降解的可能原因
(2)提高 DNA 产量的措施