水稻总DNA的快速少量抽提CTAB法

相关专题

 

DNA 分子 是分子生物学研究的基本材料，依不同的实验目的可采取不同的抽提方法获取数量和质量不等的 DNA 。

实验目的：了解植物 DNA 抽提的主要方法，掌握 CTAB 法快速抽提水稻 DNA 。

实验材料及试剂： 水稻叶片，1.5 × CTAB ，氯仿 / 异戊醇 (24:1) ，95% 乙醇或无水乙醇等

实验原理：植物 DNA 的抽提常采用两种方法：

(1)SDS 法： 离子去污剂，过程长，纯度高;

(2)CTAB 法：该方法简便、快速，DNA 产量高 ( 纯度稍次，适用于一般分子生物学操作 ) 。CTAB 是一种非离子去污剂，植物 材料在 CTAB 的处理下，结合 65℃ 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来 。CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐 (>0.7mM ) 浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度 ( 0.1-0.5mM NaCl )下CTAB- 核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB- 核酸复合物再用 70 - 75% 酒精浸泡可洗脱掉 CTAB 。再经过氯仿 / 异戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化 DNA ，最后经异丙醇或乙醇等 DNA 沉淀剂将 DNA 沉淀分离出来。

实验步骤：

1.采集适量幼嫩叶片，用液 N2 研成粉末，0.4 g 装入 1.5ml 离心管中( -20 ℃预冷)。

2.预热 1.5 × CTAB 到 95 ℃，加 1ml 到装有叶片粉末的离心管中，混匀(防止冻融)。

3.立即置于 65 ℃水浴 30min ，每 5 min，上下颠倒 1 次。

4.12000g 离心 5 min。

5.吸取上清液约 600μl ，加入等体积( 600μl )氯仿 / 异戊醇 (24:1) ，上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。

6.12000g 离心 5 分钟。

7.取 450μl 上清于一新 1.5ml 离心管，加入 1ml 95% 乙醇和 45μl 10M NH4AC ，混匀，室温放置 10min 。

8.12000 g 离心 10min ，去上清，用 75% EtOH 浸洗沉淀，自然干燥约 30 min 。

9.加入 50μl 1/10 TE 或无菌水(含 20μg/RNase )，置于 4 ℃过夜，待 DNA 溶解后，检测 DNA 浓度及质量。

注意事项：

1.尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用 10 mM 的β -ME 处理。

2.研钵预冻，粉末至加 CTAB 前不要融化。

3.24:1 的氯仿 / 异戊醇抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪宽了的。

4.所用试剂必需灭菌，手套。